ウイルスDNA-タンパク質複合体からのタンパク質の単離

アルキン修飾ヌクレオチドで標識されたウイルスゲノムを含む細胞核を用意します。

核をビオチン-アジドと銅イオンの混合液に懸濁し、インキュベートします。

銅イオンは、アジド基とアルキン基の共有結合を促進します。

遠心分離し、上清を捨てます。

バッファーで再懸濁し、転送して、遠心分離によりペレット化します。

ペレットを急速凍結させ、その後融解させることで溶解を促進します。

再懸濁し、超音波処理して核を溶解させます。

遠心分離し、タンパク質-ウイルスDNA複合体を含む上清を回収します。

上清をろ過し、不純物を除去します。

ろ液を希釈します。

ストレプトアビジンコート磁気ビーズを加え、ビオチン化されたタンパク質-DNA複合体との結合を促進させるためにインキュベートします。

磁場を印加してビーズを回収し、洗浄して不純物を除去します。

洗浄を繰り返します。

溶出バッファーを加え、加熱してタンパク質を分離および変性させます。

ビーズを分離し、溶出液を回収します。

単離したタンパク質を急速冷凍します。今後の解析のため、超低温で保存してください。

PBSを完全に除去した後、10 mLピペットを用いて5回ゆっくりとピペッティングし、核ペレットを10 mLのクリック反応ミックスに再懸濁します。サンプルを4 °Cで1時間回転させ、その後、前述と同様に核をペレット化します。

クリック反応混合液を完全に除去し、次いで、ペレットを 10 milliliters の PBS で緩やかに再懸濁して再度遠心分離し、洗浄します。次に、核ペレットを 1 milliliter の PBS で慎重に再懸濁し、溶液を 1.5 milliliter マイクロ遠心チューブに移します。遠心分離後、PBS を完全に除去し、ペレットを液体窒素で急凍結させます。

この時点で、ペレットを-80 °Cで保存するか、そのまま手順を続行できます。核を溶解させDNAを断片化するために、解凍した核を50 µLのBuffer B1にピペッティングで再懸濁します。この懸濁液を氷上で45分間インキュベートします。

次に、3 mmのマイクロチッププローブを用い、40% amplitudeで30秒間を6回、サンプルの超音波処理を行います。パルス間には、サンプルを少なくとも30秒間氷上に置いてください。超音波処理後、サンプルは濁っておらず、透明である必要があります。

4°Cで10分間、14,0 x Gで遠心分離し、細胞残渣をペレット化します。ペレットのサイズが大幅に減少することを確認し、上清を10 micronのセルストレーナーでろ過して、ろ過液を回収します。次に、ろ過した上清に500 µLのBuffer B2を加えます。

ビオチン化DNAをストレプトアビジンコートビーズに結合させるため、ビーズスラリー 30 µL を 1.5 mL マイクロ सेंटリフュージチューブに移して、ス