塩化セシウムを用いたゲノム含有アデノウイルスベクターの精製

アデノウイルスに感染させた哺乳類細胞から開始します。

凍結融解サイクルを繰り返し、細胞を溶解させてビリオンを放出させます。

溶解物を遠心分離して、デブリを沈殿させます。ウイルス粒子を含む上清を回収します。

密度に基づいた分離を行うため、ウイルス上清を段階的な塩化セシウム密度勾配の上に重層します。

ウイルス粒子をその浮遊密度に従って移動させるための超遠心機。

完全なアデノウイルスゲノムを含む完全なビリオンは、パッケージングされたDNAのために密度が高く、より低いバンドに沈降しますが、より軽い空のカプシドやデブリは上層に留まります。

上層を取り除きます。ゲノムを含むビリオンの下層バンドを回収します。

ビリオンを均一密度の塩化セシウムに再懸濁し、再度超遠心分離を行って分離を精確にし、完全粒子を濃縮します。

上層を廃棄し、下部のバンドを回収します。

塩化セシウムを除去するために、サンプルを透析します。

高純度でゲノムを含むアデノウイルスベクターが、以降のアプリケーションに使用可能な状態で準備されました。

塩化セシウム密度勾配精製用のウイルス溶解液を調製するため、細胞・ウイルス懸濁液を4回凍結融解させます。その後、ウイルス溶解液を室温で50 ×gで8分間遠心分離します。

次に、ハイキャパシティアデノウイルスを含む上清を回収します。以下の順序で、塩化セシウム溶液を慎重に、ゆっくりとチューブにピペッティングします：1.5 g/cm³溶液を0.5 mL、1.35 g/cm³溶液を3 mL、そして1.25 g/cm³溶液を3.5 mL加えます。1.25 g/cm³の層の上に、精製したベクター上清を約4.5 mL重ねます。

高容量アデノウイルスゲノムを含むウイルス粒子を、空の粒子および細胞残渣から分離するため、スイングアウトローターを備えた超遠心機を用い、12 °Cで226,0 ×gで少なくとも2時間、グラジエントを遠心分離します。遠心分離後、チューブの上部に細胞残渣の拡散したバンドが形成されます。その下方に、2本の白いバンドが観察されます。

上のバンドには空の粒子が含まれており、下のバンドが高容量アデノウイルスです。細胞のデブリと空の粒子の層を慎重に取り除きます。その後、各チューブの下のバンドから1 mLを回収します。

ウイルスを滅菌済みの50 milliliterチューブに移します。回収したウイルス粒子に1.35 grams per cubic centimeterの塩化セシウム溶液を最大24 millilitersまで加え、慎重に混合します。遠心管の上端まで1.35 grams per cubic centimeterの塩化セシウムウイルス溶液を満たします。

次に、スイングアウトローターを備えた超遠心機を用い、緩やかな加速および減速設定で、12 °C、26,0 ×gで一晩遠心分離します。ピペットを使用して上層を取り除きます。その後、新しいピペットチップを用いて、下部の明瞭なバンドに存在するハイキャパシティアデノウイルスを回収します。

最後に、回収したウイルス粒子を透析して緩衝液を置換します。その後、書面でのプロトコルの詳細な手順に従い、最終調製物のタイターを測定します。