アデノ随伴ウイルスベクターを用いたヒト化ラット肝臓への導入

ヒト肝細胞を再播種したラット肝脱細胞化スキャフォールドを含むバイオリアクターシステムを用いて開始します。

スキャフォールドは、栄養分を供給するために培地を循環させるフローシステム内で維持されます。

リコンビナントアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを含むバッファーをシリンジに充填します。

このベクターは、蛍光レポーターと遺伝子サイレンシングRNAをコードするトランスジーンカセットを含む、セルフコンプリメンタリーDNAを搭載しています。

培地の流れを停止させ、流入チューブを取り外します。

スキャフォールドに供給している主要血管を通じてベクトルを注入します。

ベクターと細胞を相互作用させるため、インキュベートする。

ベクターは受容体介在性エンドサイトーシスを介して肝細胞内に取り込まれます。

細胞内に取り込まれた後、ベクターはエンドソームから脱出し、自己相補的DNAを核内に放出します。

セルフコンプリメンタリーDNAにより、外来遺伝子が直接発現し、蛍光タンパク質および遺伝子サイレンシングRNAが産生されます。

培地の流量を徐々に再開し、スキャフォールド内の循環を回復させます。

これで、形質導入された肝臓モデルがダウンストリーム解析に使用可能な状態になります。

次に、肝臓モデルに導入を行います。まず、PBS 5 ml中に27兆個のベクターを含む溶液をシリンジに充填します。必要に応じて、5 µg/mlのフェノールレッドを添加してください。

その後、肝臓を培地回路から切り離し、システム内にベクターを注入します。注入後、ポンプを停止させた状態でシステムを1時間インキュベートします。その後、前述の方法に従って、徐々に流量を増加させます。

その後、導入後の肝臓を6日間にわたってインキュベートし、1日おきに培地を50 ml交換します。