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凍結保存用媒体に包埋された、ヒト肝細胞を含む凍結再細胞化ラット肝組織から開始します。
この組織において、導入された肝細胞は、ウイルスベクターによってコードされたレポータータンパク質であるエメラルドグリーン蛍光タンパク質（EmGFP）を発現しています。
クライオトームを用いて、細胞および組織構造を保持した薄切片を作成します。切片をスライドグラスに転写します。
細胞膜を透過させるため、切片を低濃度の界面活性剤で処理します。
形質導入された細胞に発現している蛍光レポータータンパク質に特異的に結合するanti-EmGFP一次抗体を適用します。
洗浄して、結合していない抗体を除去します。
一次抗体に結合する赤色蛍光色素標識二次抗体を導入し、その後洗浄します。
細胞DNAに結合するDNA特異的な青色蛍光染料を添加します。
蛍光顕微鏡下で、赤色蛍光と青色に染色された核の共局在を確認することにより、肝組織内の導入された肝細胞がウイルスレポータータンパク質を正常に発現していることが確認されます。
メスを使用して、各肝葉から厚さ約0.5 cm、長さ1.5〜2 cmのサンプルを切り出します。切り出したサンプルを4%パラホルムアルデヒドおよび4%スクロース溶液中で、4 °Cで90分間インキュベートします。
その後、サンプルをPBSで1分間ずつ3回洗浄します。洗浄後、サンプルを8% sucrose溶液中で4 °Cにて一晩インキュベートします。翌日、少量の固定剤を入れたクライオモールドにサンプルをセットします。
気泡が入らないように注意してください。サンプルをセットしたら、固定剤で完全に覆い、-80 °Cで保存します。凍結後、クライオトームを用いてサンプルから10 µmの凍結切片を作製します。
必要に応じてサンプルを染色し、再細胞化を確認します。