気液界面で培養したヒト鼻上皮細胞におけるウイルスの増殖

マルチウェルプレートのトランスウェルインサート上で培養され、粘液で覆われたヒト鼻上皮細胞を用いて開始します。

培養物の基底側は培地に接し、頂端面は空気にさらされており、これにより鼻腔の気液界面（air-liquid interface）が模倣されています。

緩衝液で培養物を洗浄し、粘液層を除去します。

無血清培地に懸濁したコロナウイルスを培養物に添加します。

ウイルスが吸着するように、時折プレートを揺らしながらインキュベートします。

ウイルス接種液を除去し、緩衝液で洗浄して未結合のウイルスを取り除きます。

インサートを取り出し、ウェルに新鮮な培地を補充します。

ウイルス感染させるためにプレートをインキュベートします。

コロナウイルスは細胞表面の受容体に結合し、エンドサイトーシスによって細胞内に侵入し、ゲノムを細胞質に放出します。

ウイルスゲノムが複製してタンパク質を産生し、それらが組み合わさって新しいウイルス粒子となります。

新たなウイルスが頂端側へ放出され、近接する細胞に感染し、ウイルスの増殖が促進されます。

基底側および頂端側のチャンバーを備えたトランスウェル内で、鼻腔気液界面（ALI）培養物を増殖および分化させます。解離させたヒト副鼻腔細胞を液浸条件下で拡大培養し、その後、頂端側チャンバーから培地を除去して、気液界面での培養物の分化を促します。

感染の前日に、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いてALI培養物を頂端側から洗浄します。具体的には、各トランスウェルの頂端側に加温したPBSを200 µL加え、プレートを37 °Cで5分間インキュベートします。PBSを吸引し、この洗浄工程をさらに2回繰り返します。

その後、基底側培地を1ウェルあたり500 µLの新鮮な培地と交換し、予定している感染温度で一晩培養して平衡化させます。翌日、ウイルスを無血清DMEMで希釈し、総接種量50 µLで目的の感染多重度（MOI）になるように調製します。ウイルス接種液を培養物の頂端側に添加し、インキュベーターに戻して1時間静置します。

インキュベーション中、15分ごとにプレートを両手でしっかりと持ち、前後および左右に緩やかに揺らし、ウイルス接種液を均一に吸着させます。インキュベーション後、ウイルス接種液を吸引し、前述の方法で各感染培養物をPBSで3回洗浄して、接種液を完全に除去します。必要に応じて、3回目のPBS洗浄液を回収し、投入ウイルスが十分に除去されたことを確認してください。

感染させたALIの基底側培地を72時間ごとに交換してください。