0 閲覧数 • 3:33 分 • August 31st, 2026
ヒト細胞培養物を用意する。
オペレーターに融合したテトラサイクリン応答性プロモーターの下で、条件付きホストmRNA標的shRNAをコードするレンチウイルスを添加します。
このレンチウイルスは、構成的プロモーターの下に配置されたテトラサイクリンリプレッサーおよび抗生物質耐性タンパク質の遺伝子も保持しています。
ウイルスRNAが宿主細胞内に導入されるまでインキュベートします。
RNAがcDNAに変換され、宿主ゲノムに組み込まれます。
洗浄し、培地を添加してインキュベートすることで、テトラサイクリンリプレッサーと抗生物質耐性タンパク質を発現させ、導入細胞を生成します。テトラサイクリンリプレッサーがオペレーターに結合し、shRNAの発現を抑制します。
洗浄し、抗生物質を添加した培地を加えてインキュベートする。
導入された細胞は抗生物質耐性タンパク質を発現するため、抗生物質が存在する条件下で選択的に生存することが可能になります。
テトラサイクリン類似体であるドキシサイクリンを培地に添加します。
ドキシサイクリンがテトラサイクリンリプレッサーに結合することで、リプレッサーのオペレーターへの結合が妨げられ、shRNAの発現が可能になります。
shRNAはsiRNAへとプロセシングされ、それがRISCに取り込まれることで標的mRNAを分解します。
これにより、ドキシサイクリン依存的な条件付きノックダウン細胞が作製されます。
安定した細胞株を構築するため、まずHCT-116結腸がん細胞およびMDA-MB-231乳がん細胞を12ウェルプレートに、1ウェルあたり50,0 cellsで播種します。
37 °C、5% CO2でインキュベートします。細胞が60-70%コンフルエントになったら、PBSで細胞を洗浄し、各ウェルにウイルス含有培地を1 mL添加します。翌日、吸引によってウイルス含有培地を慎重に除去します。
その後、細胞をPBSで洗浄し、テトラサイクリンフリーFBSを含む培地を加えます。72時間後、同様に細胞を洗浄し、ウイルス導入細胞を選別するため、1 µg/mLのピューロマイシンを添加した培地を加えます。ピューロマイシン存在下で3〜14日間細胞を培養し、ウイルス導入細胞を選別します。
ウイルス導入した細胞を含むウェルにおいて、ピューロマイシンによる細胞の部分的な死滅を確認します。非導入細胞は、ピューロマイシンの存在下では増殖しません。
異なる濃度のdoxycyclineを含む培地を添加し、細胞を72時間培養することで、ピューロマイシン耐性を有するHCT-16大腸がん細胞およびMDA-MB-231乳がん細胞における条件付きノックダウンの効率を検証します。