段階的ショ糖遠心分離法によるウイルス濃縮懸濁液の調製

ショ糖勾配を含む超遠心管を用意します。

ウイルスを含む上清を、上に慎重に加えます。

グラジエントを保持するため、加速と減速を制御して遠心分離を行い、回転中に粒子が自身の浮遊密度に一致する層に沈降するようにします。

より低分子のタンパク質は上層に留まります。完全なウイルス粒子は低密度層と高密度層の間に濃縮され、より重量のある細胞残渣は底辺に沈殿します。

上層を捨て、ウイルスが濃縮された中央のショ糖画分を新しいチューブに回収します。

緩衝液を加え、サンプルを数回混合する。

次に、新しいチューブに低密度のスクロースクッションを用意し、その上にウイルス懸濁液を慎重に重層させます。

懸濁液を遠心分離します。比重の重いウイルス粒子は底に沈殿し、軽い不純物は上清に残ります。

上清液を廃棄します。チューブをペーパータオルの上に逆さまにして、残った液体を切り出します。

ウイルスのペレットをバッファーで再懸濁します。

ウイルス濃縮懸濁液が完成し、後続の研究に使用可能な状態になります。

コニカル型超遠心管に異なる濃度のスクロースを満たし、スクロース勾配による層を形成させます。

ウイルスを含む上清を、ショ糖密度勾配に慎重に加えます。100 mLのウイルス上清全量を処理するため、1回の遠心操作につき6本の超遠心管を使用します。次に、超遠心管を1X PBSバッファーでバランス調整し、サンプルを70,000 x gで2時間、17 °Cで遠心分離します。

清潔なチューブに30%および60%のショ糖画分を回収し、冷えた1X PBSバッファーを加えて容量を100 millilitersに調整します。ピペッティングを数回繰り返し、サンプルを混合します。次に、1X PBS溶液中の20%ショ糖4 millilitersの上に、ウイルス溶液20～25 millilitersを慎重に重層し、ショ糖クッションを調製します。

チューブの液量が全容量の4分の3未満である場合は、滅菌済みの1X PBSバッファーで容量を調整し、バランスを合わせます。その後、サンプルを17 °Cで2時間遠心分離します。次いで、上清を捨て、チューブをペーパータオルの上に逆さまにして残った液体を切り捨てます。

最後に残った液滴を吸引すると、ウイルスを含むペレットが半透明の点としてかろうじて確認できます。次に、70 µLの1X PBSを加え、ピペッティングを十分に行うことでペレットを再懸濁させます。さらに、この懸濁液を別のチューブに移し、十分に混合してペレットを完全に溶解させます。

次に、さらに 50 µL の冷 1X PBS バッファーでチューブを洗浄し、混合します。サンプルを卓上マイクロ遠心機にかけ、10,000 x g で 30 秒間遠心分離します。遠心分離後、上清を 10 µL ずつ新しいマイクロ遠心チューブに分注し、-80 °C で保存します。