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検出用のタンパク質マーカーであるHIV-1 p24抗原を含むレンチウイルスベクターを用意します。
界面活性剤を加えてp24を溶解・遊離させ、その後、サンプルを段階希釈します。
anti-p24モノクローナル抗体および非特異的結合を防止するためのブロッキング剤でコートしたマイクロプレートを用意する。
希釈したサンプルおよび参照用としてp24標準液を添加します。
p24が特異的エピトープを介して抗体と相互作用するようにインキュベートし、その後、未結合成分を除去します。
p24上の異なるエピトープに結合するanti-p24ポリクローナル抗体とともにインキュベートし、未結合の抗体を除去します。
ポリクローナル抗体に結合するペルオキシダーゼ標識抗体を添加します。未結合の抗体を除去します。
有色生成物へと変換されるペルオキシダーゼ基質を添加します。
酸を添加してペルオキシダーゼを不活化し、生成物を安定させます。
色強度の吸光度を測定します。これはp24濃度に比例します。
標準曲線を作成し、サンプルの濃度を推定してウイルス力価を決定します。
NIH AIDS Vaccine ProgramのHIV-1 p24抗原キャプチャーアッセイキットに従い、1:1,500に希釈したモノクローナルanti-p24抗体100 µLを用いて、ハイバインド96ウェルプレートをコーティングする。プレートを4 °Cで一晩インキュベートする。翌日、冷PBS中の0.05% Tween 20を200 µL用いて、プレートを3回洗浄する。
非特異的結合を避けるため、200 µLの1%牛血清アルブミンを用いて、室温で1時間プレートをブロッキングします。次に、冷PBS中の0.05% TWEEN-20 200 µLでプレートを3回洗浄します。その後、二回蒸留水とTriton X-100でベクターを希釈し、濃縮および非濃縮ベクターサンプルの最終濃度を10%に調製します。
次に、5 ng/mLを始点として2倍連続希釈を行い、HIV-1標準試料を調製します。濃縮および非濃縮のベクター試料を希釈した後、プレートに3連で分注し、4 °Cで一晩インキュベートします。翌日、プレートを洗浄し、各ウェルにポリクローナルウサギ抗p24抗体を100 µL加え、37 °Cで4時間インキュベートします。
6回洗浄した後、プレートにヤギ抗ウサギホースラディッシュペルオキシダーゼを加え、37 °Cで1時間インキュベートする。複数回洗浄した後、TMBペルオキシダーゼ基質と共にプレートを室温で15分間インキュベートする。1 N 塩酸を加えて反応を停止させる。その後、プレートリーダーを用いて450 nmの吸光度を測定する。