プラスミドトランスフェクションによる組換えアデノ随伴ウイルスの作製

栄養培地に懸濁させたプラスミド混合物から開始します。

1つ目のプラスミドには、目的遺伝子をコードする組み換えアデノ随伴ウイルス（AAV）ゲノムが組み込まれています。

2つ目のプラスミドは、RepおよびCapタンパク質をコードしています。

3番目のプラスミドはヘルパータンパク質をコードしています。

プラスミド溶液にトランスフェクション試薬を添加します。よく混ぜ合わせ、インキュベートします。

正電荷を持つトランスフェクション剤が負電荷を持つプラスミドDNAに結合し、複合体を形成します。

複合体を哺乳類細胞の単層に導入し、インキュベートします。

複合体はエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれます。

細胞内において、プラスミドにコードされた遺伝子がウイルス蛋白の発現を誘導します。

Repタンパク質がウイルスゲノムを複製し、Capタンパク質がカプシド殻を形成します。

Repタンパク質は、ヘルパータンパク質とともに、複製されたウイルスゲノムをカプシドにパッケージングし、完全なAAV粒子を形成します。

目的遺伝子を組み込んだ組換えAAVベクターが、遺伝子導入アプリケーションに使用可能な状態で調製されました。

テキストプロトコルに従ってrAAV9構築物の作製とHEK293細胞の培養を行った後、1日目に細胞をトランスフェクションするため、50 ml遠心チューブに70 µgのAAV Rep-Capプラスミド、70 µgのrAAV9プラスミド、および200 µgのAdヘルパープラスミドを混合します。チューブにFBS不含の室温DMEMを49 ml加え、十分に混ぜ合わせます。次に、PEIとDNAの比率を4:1にするため、1,360 µLのPEIをチューブに加え、十分に混ぜ合わせます。

溶液を室温で15〜30分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞が入った150 mmディッシュそれぞれに溶液を5 mlずつ加えます。細胞を37 °C、5% CO₂条件下で50〜72時間培養します。