JoVE 実験百科事典
微生物学
0 回視聴 • 5:56 分 • August 31st, 2026
細胞タンパク質およびウイルス粒子と凝集した細胞DNAを含む細胞溶解液から開始します。
マグネシウムイオンを添加し、続いてヌクレアーゼを加えて、細胞DNAの酵素分解を活性化させ、DNA-タンパク質凝集体を解消させます。
遠心分離してデブリを除去し、ウイルス粒子を含む上清を回収します。
上清を、上から下に向かって濃度が上昇するように設定した不連続ヨジキサノール勾配の上に重層し、チューブの残りを緩衝液で満たします。
密度に基づいて成分を分離するための超遠心機。ウイルス粒子は高密度層と中密度層の界面に蓄積します。
この界面に針を挿入し、ウイルス粒子をチューブに回収します。
ウイルス粒子の凝集を防ぐため、安定化成分を含むバッファーを添加します。
次に、溶液をメンブレンフィルター付きのチューブに移します。
遠心分離を行い、フィルターの上にウイルス粒子を濃縮します。
安定剤を添加したバッファーを加え、再度遠心分離して精製ウイルス粒子を得ます。
形質転換した細胞を回収するため、培地を用いてピペッティングし、細胞を剥離させて懸濁させます。次に、細胞懸濁液を滅菌済みの50 mLチューブに移します。細胞を500 ×gで5分間遠心分離します。
次に、各チューブに5 mLのPBSを加え、細胞ペレットを再懸濁させた後、すべての懸濁液を1本の50 mLチューブにまとめます。細胞を500 ×gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。AAVを精製するため、ペレットを10 mLの溶解バッファーで再懸濁します。
溶解物を-80°Cまたはドライアイス・エタノール浴で凍結させます。その後、37°Cで融解させます。溶解物を1分間ボルテックスし、凍結・融解操作をさらに2回繰り返します。
次に、解凍した溶解液に1 mMの塩化マグネシウムを加えます。続いて、最終濃度が250 units/mLになるようにヌクレアーゼを加えます。この溶液を37 °Cで15分間インキュベートし、DNA-タンパク質凝集体を溶解させます。
サンプルを4,800 ×g、4 °Cで20分間遠心分離し、上清を回収します。その間に、17% iodixanol密度勾配溶液を調製するため、10X PBS 5 mLに、1 M 塩化マグネシウム 0.05 mL、1 M 塩化カリウム 0.125 mL、5 M 塩化ナトリウム 10 mL、および密度勾配媒体 12.5 mLを混合します。
水を加えて全量を50 millilitersに調整します。テキストプロトコルに従って25%、40%、および60%の勾配溶液を調製した後、針とシリンジを用いて、17%の勾配溶液5 millilitersをポリプロピレンチューブに注入します。続いて、25%、40%、および60%の勾配溶液をそれぞれ5 millilitersずつ注入します。
溶出液を密度勾配の上層に重ねます。次に、チューブを溶解バッファーで満たし、コルクで蓋をします。密度勾配を185,000 ×g、16 °Cで90分間遠心分離します。
遠心分離後、21ゲージの針を40%画分と60%画分の境界に挿入し、25%層を完全に避けて、シリンジで40%ウイルス画分を回収します。このウイルス画分を、滅菌済みのポリオキシエチレンポリオキシプロピレン（またはPEG-PPGブロック共重合体PBS溶液）で希釈し、全量を15 millilitersにします。この混合液を、分画分子量100 kilodaltonsのフィルターチューブに充填します。
次に、サンプルを 2,000 ×g、4 °C で 30 分間遠心分離します。チューブの底部から溶液をデカンテーションします。その後、PEG-PPG を用いてフィルターチューブを 15 mL まで満たします。
チューブを2,000 ×g、4 °Cで20分間遠心分離します。液の補充と遠心分離をさらに2回繰り返した後、フィルターの上に残っている精製されたrAAV9ウイルス画分を回収します。