JoVE 実験百科事典
微生物学
0 回視聴 • 3:07 分 • August 31st, 2026
ウイルスがん遺伝子および抗生物質耐性遺伝子をコードするレトロウイルス粒子を含む培地を用意する。
培地を遠心分離し、細胞残渣を除去します。
ウイルス粒子を含む上清を回収し、血管内皮細胞の培養物の上に添加します。
ウイルスが進入するようにインキュベートする。
ウイルスRNAは逆転写されてDNAとなり、それが宿主ゲノムに組み込まれます。
抗生物質耐性遺伝子は耐性タンパク質を産生します。オンコジーンは、細胞分裂を制御する腫瘍抑制タンパク質に結合してそれらを不活性化させ、細胞の寿命を延ばすタンパク質を産生します。
培地を新鮮な培地に交換します。
ウイルスDNAの安定した組み込みを確実にするため、再度インキュベートします。
培地を除去し、細胞を洗浄する。
細胞を剥離させるため、酵素解離液を加えます。
細胞懸濁液を移し、遠心分離して上清を除去します。
ペレットを再懸濁し、フラスコに移します。
培地に抗生物質を添加します。
抗生物質耐性タンパク質を発現している細胞のみが生存するため、ウイルスオンコゲンタンパク質によって不死化された細胞が選択されます。
一晩培養した後、PA317細胞培養液を回収し、室温で300 × gにて5分間遠心分離して清澄化します。50%コンフルエントな内皮細胞培養液からEGM培地を取り除き、12 mLの清澄化したPA317培地と置換します。その後、細胞を4時間培養します。
次に、PA317培地6 mLを新鮮なEGM培地6 mLに交換し、細胞を一晩インキュベートします。その後、血管内皮細胞の培養液を除去し、12 mLの新鮮なEGMを添加します。さらに48時間、細胞をインキュベートし続けます。
血管内皮細胞を継代するには、培地を除去し、カチオンフリーのPBS 12 mLで細胞を洗浄します。次に、市販の酵素解離液 3 mLを加え、細胞を37 °Cで3分間インキュベートします。細胞懸濁液を15 mLコニカルチューブに移し、室温で300 × g、5分間遠心分離します。
ペレット化した後、細胞を新鮮なEGM培地で再懸濁し、懸濁液を3本のT75フラスコに均等に分注します。各フラスコの培養液量をEGM 12 mLに調整します。その後、形質導入された血管内皮細胞を選択するため、G418を最終濃度200 µg/mLになるように添加します。