蛍光in situハイブリダイゼーションによる宿主細胞内におけるウイルスRNA分布の決定

ウイルスRNAが核および細胞質に分布している、透過処理を施したウイルス感染宿主細胞を含むスライドから開始します。

前ハイブリダイゼーション緩衝液を加え、加湿条件下でインキュベートします。

バッファー中のブロッキング剤が非特異的結合部位をブロックし、同時にRNase阻害剤がRNaseを不活性化してRNAの完全性を維持します。

バッファーを除去し、ウイルスRNAに相補的な、変性させたジゴキシゲニン標識オリゴヌクレオチドプローブを添加します。

プローブとRNAのハイブリダイゼーションを行うため、暗所でインキュベートし、その後、繰り返し洗浄します。

プローブ-RNAハイブリッドを安定させるために固定液を加え、その後、繰り返し洗浄します。細胞の透過性を維持するために、界面活性剤を添加したバッファーを加えます。

ジゴキシゲニンと反応する緑色蛍光色素標識抗ジゴキシゲニン抗体を添加し、その後、繰り返し洗浄する。

複合体を保持するために細胞を固定し、その後、再度洗浄します。

核を染色するためにDNA結合染料を添加します。過剰な染料を繰り返し洗浄します。

カバーガラスで封入し、密閉します。

共焦点顕微鏡を用いて、宿主細胞の核および細胞質におけるウイルスRNAの分布を反映する緑色蛍光を可視化します。

示された通りにPBSで3回洗浄した後、2回目の透過処理を行う前に、PBS溶液中の4% formaldehydeでサンプルを10～15分間再び固定します。その後、蛍光信号を保持し光退色を防ぐため、スライドをアルミホイルで覆います。

細胞を2x saline sodium citrateで洗浄した後、45 µLのハイブリダイゼーション溶液を適用します。加湿チャンバー内にて37 °Cで1時間置いた後、目的のアンチセンスオリゴヌクレオチドに蒸留水を加え、変性液の容量を10 µLにします。オリゴヌクレオチドを95 °Cで5分間変性させ、その後、スライド1枚あたり35 µLの新鮮なハイブリダイゼーション溶液を加えます。

その後、サンプルをアルミホイルで遮光し、湿潤箱内で37 °Cで10～24時間インキュベートします。翌日、室温で2X SSC（塩化ナトリウム・クエン酸ナトリウム溶液）を用いて10分間の洗浄を2回行い、続いて25 °Cで1X SSCを用いて10分間1回洗浄します。

最後の洗浄後、あらかじめ冷却したPBS希釈4%ホルムアルデヒドを用いて、氷上で10-15分間細胞を固定し、続いて新鮮なPBSで3回洗浄します。次に、実演通りにサンプルの透過化を行い、続いて抗ジゴキシゲニン-FITCおよびあらかじめ冷却したPBS希釈0.1%BSAとともに、4℃で1時間インキュベートします。インキュベーション終了後、スライドを新鮮なPBSで3回洗浄し、あらかじめ冷却したPBS希釈4%パラホルムアルデヒドを用いて、4℃で10-15分間サンプルを固定します。

PBSで3回洗浄した後、0.4 $\mu$g/mLのDAPIおよび冷やした0.5% Triton-X含有PBSを用いて、氷上で15分間核を染色し、最後にPBSで3回洗浄します。実験的な必要に応じて、蛍光ビーズとともに適切な封入剤を用いてスライドを封入します。滅菌ワイプで余分な封入剤を取り除いた後、各スライドのカバーガラスを透明なネイルポリッシュで数回塗り重ねて密封し、蛍光顕微鏡を用いて実験が正常に完了したことを確認してください。

その後、共焦点顕微鏡を用いて、封入後1時間から1週間の間に、630倍の倍率でサンプルの画像を撮影します。