トランスクリプトーム解析のためのプロファージ溶菌複製誘導

ファージリプレッサータンパク質によって抑制され、休眠状態の溶原化相を維持している、統合プロファージゲノムを保持する細菌培養物から開始します。

誘導剤を添加し、振盪培養して細胞ストレスを誘発させます。

細胞ストレスによってリプレッサータンパク質の自己切断が誘導され、プロファージが溶原性から溶解性複製へと移行します。

プロファージDNAが細菌ゲノムから切り出され、その後、初期調節遺伝子、中期DNA複製遺伝子、そして後期の構造遺伝子および溶菌遺伝子が順次転写されます。

誘導剤を希釈するために培養液を大容量の培地に移し、細胞を回復させるためにインキュベートします。

規定の間隔でストップ溶液を加え、転写を停止させ、細菌細胞内のRNAプロファイルを保存します。

培養液を遠心分離し、上清を捨てる。細胞を再懸濁して懸濁液を小型チューブに移し、遠心分離する。

上清液を除去し、RNAの完全性を維持するためにペレットを急速冷凍します。

最後に、RNA抽出試薬を加え、ホモジナイズして細胞を破壊します。これでサンプルがRNA単離およびその後のトランスクリプトーム解析に使用可能な状態になります。

次に、80 mLの培養液が入った誘導用ラベル付きフラスコに、最終濃度1 µg/mLとなるようにノルフロキサシンを添加します。よく混ぜ合わせ、37 °Cで180 rpmで振盪しながら1時間インキュベートします。誘導後の培養液80 mLを720 mLのLBに加えることで、細胞を回復させます。ステップ1.5で述べた停止液を添加し、0分から1時間まで10分おきに各フラスコから細菌細胞を回収します。

4 °Cで10,000 gにて15分間遠心分離し、上清を捨てます。調節可能なオートピペットを用いて、残液中でペレットを穏やかに再懸濁します。懸濁液を1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、4 °Cで13,000 gにて1分間遠心分離します。

残った上清を捨ててマイクロフュージチューブを密閉し、ペレットを液体窒素で急速凍結させます。凍結した各ペレットにTRIzolを1 mL加え、ピペッティングによって懸濁液を均質化します。