トランスフェクションした哺乳類細胞からのアデノ随伴ウイルスの回収

アデノ随伴ウイルスベクターを産生する、トランスフェクション済みの哺乳類細胞を含む多層細胞チャンバーを用意します。この細胞チャンバーを使用することで、高収率のウイルス回収が可能になります。

チャンバーを激しく振って接着細胞を剥離させ、ウイルスを含む細胞および細胞外ウイルス粒子を培地中に放出させます。

内容物をチューブに移し、遠心分離してウイルスを含む細胞をペレット化します。

細胞外ウイルスを含む上清を回収し、保存ボトルに移します。

ペレットを溶解バッファーで再懸濁し、インキュベートします。

バッファー中の酵素と界面活性剤が細胞を溶解し、細胞内に存在する完全なウイルスを溶液中に放出させます。

溶解物を遠心分離して細胞残渣をペレット化します。ウイルスを含む上清を回収し、細胞外ウイルスが入ったものと同じ保存ボトルに加えます。

粗ウイルス懸濁液は、さらなる精製を行うまで低温で保存してください。

インキュベーション後、細胞培養チャンバーを激しく振って細胞を剥離させ、培地が濁るまで続け、それを4本の500 mL遠心チューブに注ぎます。

4 °Cで18,000 x gにて30分間遠心分離し、細胞をペレット化します。清澄化した上清を1 LのPETGボトルに注ぎ、500 mL遠心チューブ内の細胞ペレットを50 mLの溶解バッファーで再懸濁します。チューブを37 °Cで60分間インキュベートします。

インキュベーション後、チューブを 18,000 x g で 30 分間遠心分離し、上清を同じ 1 L の PETG ボトルに移します。-80 °C で保存してください。