0 閲覧数 • 3:45 分 • August 31st, 2026
ポリヒスチジンタグ付きウイルスインテグラーゼを発現させた細菌細胞の懸濁液から開始します。
懸濁液をソニケーションして細菌の細胞膜を破壊し、インテグラーゼを放出させます。
ライセートを超遠心管に移します。
高速遠心分離を行い、細胞残渣をペレット化して上清を回収する。
次に、ニッケル担持レジンを充填したクロマトグラフィーカラムを用意し、バッファーで平衡化します。
清澄化したライセートをカラムにロードします。
ヒスチジンを含むタンパク質はニッケルに弱く結合しますが、ポリヒスチジンタグ付きインテグラーゼは強く結合します。
バッファーで洗浄して未結合のタンパク質を除去し、次にイミダゾール濃度を直線的に上昇させた溶出バッファーを加えます。
イミダゾールはヒスチジンと競合してニッケルに結合し、インテグラーゼを遊離させます。
フラクションを回収し、分注したサンプルをローディングバッファーを含むチューブに移す。
タンパク質を熱変性させ、ポリアクリルアミドゲルにロードする。
電気泳動を行い、タンパク質バンドを解析する。
不純なタンパク質を含まず、純粋なインテグラーゼを含むフラクションを特定し、それらを回収して精製ウイルスインテグラーゼを得る。
まず、プロトタイプ泡沫状ウイルスインテグラーゼを発現させた E.coliのペレット1個を氷上で解凍します。直径0.5インチのバイオホーンと直径0.125インチのテーパーマイクロチップを備えたソニケーターを使用し、チューブを氷上に置いた状態で、振幅30%で30秒間超音波処理を行います。超音波処理後、細胞サンプルを冷却した超遠心管に移し、4 °Cで120,000 ×gにて60分間遠心分離します。
遠心分離後、明確なペレットが形成され、上清は黄色を呈することがあります。上清を冷却した50 mL円錐チューブに移します。次に、1.5 mLのニッケル充填樹脂を用いて、長さ110 mm、直径5 mmのFPLCカラムを準備します。
まず、カラムをFPLC装置に接続し、バッファーを供給します。装置は、導電率および280 nmにおけるUV吸収度のリアルタイムデータを収集する必要があります。導電率とUVの測定値が安定することを確認してください。
必要に応じて、数値が安定するまでカラムにバッファーを流し続けます。スーパーループを用い、流速 0.15 mL/min、最大圧力制限 0.5 MPa でタンパク質サンプルをカラムにロードします。スーパーループを AKTA FPLC に接続してください。
カラムの洗浄とタンパク質の溶出後、初期のフロースルー、洗浄液、および280 nm吸収ピーク分画から15 µLずつ分注し、各サンプルに2X SDS-PAGEサンプルバッファーを15 µL加える。サンプルを3分間加熱し、沸騰させる。各サンプル10 µLと、あらかじめ染色されたタンパク質標準試料4 µLを10% SDS-PAGEゲルにロードする。
ゲルを視覚的に確認し、ほぼ純粋な prototype foamy virus integrase を含んでいると思われるフラクションを特定します。これらのフラクションを回収し、ピペッティングしながらその液量を記録します。通常、液量は 8 ～ 10 mL となります。