ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーを用いたウイルスインテグラーゼの精製

不純物として細菌由来のヌクレアーゼが残留している、精製後のウイルスインテグラーゼ酵素画分を用いて開始してください。

低塩濃度の結合バッファーで平衡化したheparin-Sepharoseカラムにサンプルをロードします。

混合物がカラムを通過する際、インテグラーゼは混入しているヌクレアーゼよりもヘパリンリガンドに強く結合します。

次に、カラムに流すバッファーの塩濃度を徐々に上げます。

低塩濃度では弱く結合したヌクレアーゼが先に溶出し、強く結合したインテグラーゼはより高い塩濃度で後に溶出します。

不純物であるヌクレアーゼをインテグラーゼから分離するため、溶出フラクションを個別に回収します。

各フラクションにSDS-PAGEサンプルバッファーを加え、加熱してタンパク質を変性させる。サンプルをSDS-PAGEゲルにロードし、電気泳動分離を行う。

染色したゲルを観察する。

目に見える汚染タンパク質がなく、インテグラーゼの顕著なバンドが含まれている画分を特定し、外見上の純度を確認します。

プロトタイプ泡沫ウイルスインテグラーゼ（prototype foamy virus integrase）のヘパリンアフィニティークロマトグラフィー分画を行うには、サンプルに1.5容量のバッファーCを加えて、塩化ナトリウム濃度を200 mMまで下げます。その後、希釈したプロトタイプ泡沫ウイルスインテグラーゼサンプルを、流速0.5 mL/min、最大圧力制限1.0 MPaでヘパリンセファロースカラムにロードします。カラムの洗浄、およびグラジエント分画と最終洗浄液の回収後、ロードサンプル、フロースルー、洗浄液、および各フラクションを8% SDS-PAGEで分析します。

その後、ゲルをクマシーブルーで染色して分画を評価します。プロトタイプ泡沫ウイルスインテグラーゼと混入しているヌクレアーゼは、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーに対して異なる親和性を持ちます。ヌクレアーゼアッセイに使用するため、ほぼ純粋なプロトタイプ泡沫ウイルスインテグラーゼが含まれていると思われるヘパリンセファロース分画を特定します。