プラークアッセイによるシュードウイルス粒子の定量

哺乳類上皮細胞を含むマルチウェルプレートを用意する。

コロナウイルススパイクタンパク質を含む擬似ウイルスの段階希釈液を調製します。

各ウェルの培地を、希釈したウイルス懸濁液に交換します。

ウイルススパイクタンパク質が宿主細胞の受容体に結合するように、時々揺らしながらインキュベートします。

培地を除去します。ウイルスの拡散を制限する半固形オーバーレイを形成するため、メチルセルロースを含む培地を添加し、インキュベートします。

ウイルスが細胞に侵入し、RNAゲノムを放出します。

このRNAは、新しいウイルスRNAおよびタンパク質の合成を指令し、それらが会合してウイルス粒子となり、細胞外へ放出されます。

放出されたウイルスが隣接する細胞に感染し、プラークと呼ばれる透明な領域を形成します。

オーバーレイを除去し、細胞を洗浄する。

染色液を加え、振盪しながらプレートをインキュベートする。

ウェルを洗浄し、乾燥させる。

染料によって細胞が染色される一方で、プラーク部分は無染色のままとなります。

各ウェル内の可視プラーク数をカウントし、ウイルス濃度を決定する。

ウイルス力価を決定するために、Vero E6細胞を6ウェルプレートに6 × 10⁵ cells/wellの播種密度で播種し、一晩インキュベートします。翌日、7本のマイクロ遠心チューブに培地を900 µLずつ加え、最初のチューブにウイルスストック液を100 µL加えることで、ウイルスストックの10倍連続希釈系列を作成します。短時間ボルテックスした後、希釈したウイルス液を100 µLずつ次のチューブへ順次移し、チューブ間でボルテックスを行います。その後、Vero E6細胞の培養プレートの各ウェルの上清を、10⁻²から10⁻⁷まで希釈したウイルス液500 µLに置換します。

細胞培養インキュベーターで15分ごとに緩やかに揺らしながら45分間インキュベートした後、接種液をオーバーレイ溶液に交換し、5% CO₂条件下、34 °Cで細胞を48時間インキュベートします。インキュベーション終了後、クリスタルバイオレット染色によりプラークを可視化するため、各ウェルに0.1%クリスタルバイオレット 2 mLを加える前に、細胞をPBSで1回洗浄します。プレートをロッカースタンドに置き、室温で約20分間静置した後、各ウェルをPBSで2回緩やかに洗浄します。

最後の洗浄の後、プレートを少なくとも1時間自然乾燥させ、示された計算式を用いて各ウェルのウイルス力価をplaque forming units per milliliterで算出します。