患者血清を用いたコロナウイルススパイクタンパク質発現擬似ウイルスの抗体介在性中和

試験ウェルに、コロナウイルス特異的抗体を含む加熱不活化済みの患者血清を入れたマルチウェルプレートを用意します。コントロールとして、健康なヒト血清を含めてください。

コロナウイルスのスパイクタンパク質を発現し、緑色蛍光タンパク質をコードするRNAを保有する擬似ウイルスを血清サンプルに添加し、インキュベートします。

テストウェルでは、抗体がスパイクタンパク質に結合してシュードウイルスを中和しますが、コントロールウェルでは、非特異的抗体はスパイクタンパク質に結合せず、シュードウイルスは未結合のままとなります。

混合液を上皮細胞単層に添加します。ウイルス吸着させるためにインキュベートします。

ウイルスの拡散を制限するため、各ウェルに半固形オーバーレイ培地を加えます。その後、インキュベートします。

コントロールでは、未結合の擬似ウイルスが細胞受容体に結合して細胞内に進入し、RNAを放出してGFPを発現させ、蛍光感染フォーカスを形成します。

テストウェルにおいて、抗体によって中和された擬似ウイルスは細胞への進入ができず、感染フォーカスの形成が抑制されます。

蛍光イメージャーを用いて、蛍光感染フォーカス数を計測します。

コントロール群に多数のフォーカスが見られるのに対し、テストウェルに感染フォーカスが認められないことは、患者血清によるシュードウイルスの抗体介在性中和を確認するものである。

中和試験のために細胞を播種するには、マルチチャンネルピペットを使用して、2 × 10⁵ cells/mLの密度でVero E6細胞100 µLを96ウェルプレートの各ウェルに添加し、37 °C、5% CO2条件下で24時間インキュベートします。翌日、試験対象となる患者血清検体を56 °Cの水槽で30分間加熱不活化します。

次に、空の96ウェル組織培養プレートを用いて患者血清サンプルの10倍段階希釈系列を作成します。行Aの各ウェルに、抗生物質含有無血清DMEM 72 µLに対し、血清 8 µLを添加します。その後、行BからGの各ウェルに無血清DMEM 40 µLを、行Hの各ウェルに80 µLを添加します。12チャンネルマルチチャンネルピペットを用いて行Aのサンプルを混合し、行Aの各ウェルから行Bの各ウェルへサンプル 40 µLを移します。混合後、行Fに至るまで、続く各行のウェルで同様に希釈を繰り返します。次に、行AからGの各ウェルに、感染多重度（MOI）0.05のVSV spike EGFP 40 µLを添加し、ピペッティングで4～5回混ぜた後、プレートを37 °C、5% CO2条件下で1時間インキュベートします。インキュベーション終了後、Vero E6培養プレートの各ウェルから上清を慎重に吸引し、サンプル希釈プレートの各ウェルから抗体・ウイルス混合液 60 µLを、細胞培養プレートの対応するウェルへ移します