蛍光レポーターを用いたワクシニアウイルスにおけるステージ特異的遺伝子発現のモニタリング

組換えワクシニアウイルスに曝露させた哺乳類細胞を含むマルチウェルプレートから開始します。

この組換えウイルスは、緑色、赤色、および青色の蛍光タンパク質をコードしており、それぞれが段階特異的なプロモーターによって制御されているため、遺伝子発現の初期、中期、および後期の段階を追跡することができます。

ウイルスは受容体介在性エンドサイトーシスによって細胞内に進入し、細胞質にウイルスコアを放出します。

ウイルスコア内の転写装置が、緑色蛍光で標識される早期遺伝子の発現を促進します。

早期タンパク質がゲノムの脱殻を媒介してウイルスDNAを細胞質に放出し、そこでDNAポリメラーゼがウイルスゲノムを複製します。

次に、赤色蛍光で示される中間遺伝子の発現により、後期遺伝子の活性化に不可欠な転写因子が産生されます。

その後、青色蛍光によって示される後期遺伝子の発現により、成熟したビリオンの形成に必要な構造タンパク質が生成されます。

固定液を添加し、短時間インキュベートして蛍光を保持させます。

固定液を除去し、バッファーを加えます。

分光光度計を用いて蛍光を測定し、感染細胞におけるステージ特異的なウイルス遺伝子発現量を定量します。

まず、10 cmディッシュで培養したHeLa細胞を剥離させてください。細胞を成長培地で約2.0 x 10⁵ cells/mlに希釈します。次に、黒壁透明平底96ウェルプレートの各ウェルに100 μlずつ分注してください。細胞を37 °C、5% CO₂インキュベーター内で、コンフルエントになるまで24時間培養します。ウイルスの希釈にあたり、TrpVとPLVを37 °Cのウォーターバスで解凍し、5分間超音波処理して凝集を解消します。次に、37 °Cに予熱した感染培地を用いて、ウイルスストックを1.0 x 10⁷ PFU/mlに希釈してください。

細胞に感染させるため、各ウェルの増殖培地を50 µLの希釈ウイルスに置換します。各処理について、背景蛍光を補正するため、3つの複製ウェルにTrpVを、別の3つの複製ウェルにPLVを感染させます。37 °C、5% CO2インキュベーター内で18時間培養します。翌日、各ウェルの感染培地に100 µLの8%パラホルムアルデヒドを添加して細胞を固定します。プレートを室温で15分間、遮光してインキュベートします。

2倍量または8%のパラホルムアルデヒドを感染培地に直接加えることで、未固定のウイルスを直接廃棄容器に廃棄した際に起こりうるウイルスのエアロゾル化を防ぐことができます。15分後、プレートを廃棄容器に反転させて固定液を除去します。次に、室温のPBSを100 μL加え、光学的に透明な粘着フィルムでプレートを密封します。すぐに測定しない場合は、プレートを4 °Cで保存してください。結露によって分光光度計の測定値に誤差が生じるのを防ぐため、測定前に