感染昆虫個体からのウイルスの単離および精製

キレート剤を含む緩衝液に懸濁したウイルス感染昆虫の個体を用意します。

昆虫組織を破砕して、ウイルス粒子や反応性金属イオンを含む細胞内成分を放出させるためにホモジナイズします。

キレート剤が金属イオンに結合することで、活性酸素種の生成を抑制し、ウイルス粒子を酸化損傷から保護します。

超遠心分離機を用いてウイルスと不溶性残渣をペレット化し、その後、上清を捨てる。

塩および界面活性剤を含む緩衝液を加え、繰り返しピペッティングしてペレットを再懸濁させます。界面活性剤が脂質の多いデブリを溶解し、それに結合しているウイルス粒子を遊離させます。

遠心分離して不溶性不純物を沈殿させます。ウイルス粒子を含む上清を回収します。

上清をろ過して残存するデブリを除去し、ウイルスを含むろ液を回収します。

過剰な界面活性剤と緩衝液塩を除去するため、ろ液を低温の水中で透析します。

ウイルス粒子が沈殿するまで、定期的に水を交換します。これでウイルスは次工程に使用可能な状態になります。

ウイルス陽性のH. vitripennisの全組織を、0.02% DETCAを含むリン酸緩衝液中で、組織の大きな塊がなくなるまで約10秒間隔でボルテックスミキサーを用いて均質化します。その後、4 °Cで16時間、22,000 gの超高速遠心分離を行い、ウイルスを抽出します。

上清を廃棄した後、ペレットを回収し、0.4% sodium deoxycholic acidおよび4% polyethylene glycol hexadecyl etherを含む10 mM リン酸緩衝液 5 mlで溶解させます。ペレットを十分に混合させるため、必要に応じてチューブの壁面からペレットを剥がし、押し潰します。300 x gで15分間遠心分離した後、上清を除去し、溶液を0.45 μmフィルターでろ過して、ろ液を大きな回収チューブに回収します。

必要に応じてDETCAを含まない10 mMリン酸緩衝液を少量使用し、ろ液を分画分子量（MWCO）3.5 kDの透析膜に移します。透析膜を、4 °Cの2回蒸留水で満たした大きなビーカーに入れます。膜の中に白い沈殿が生じるまで、5〜6時間、1時間ごとに水を交換してください。