哺乳類細胞における組換えレンチウイルスの作製

低血清培地で培養した哺乳類細胞から開始します。

DNA-脂質複合体を細胞に添加する。

この複合体には、レンチウイルスパッケージングプラスミドと、目的遺伝子をコードする発現プラスミドが含まれています。

複合体が細胞内に取り込まれるまでインキュベートします。

培地を交換して残留したトランスフェクション試薬を除去し、インキュベートする。

細胞内に入ったプラスミドDNAは核に移行し、目的遺伝子を含むウイルスRNAおよび、カプシドタンパク質、エンベロープタンパク質、逆転写酵素、インテグラーゼなどのウイルス構成成分の合成を指令します。

これらの構成要素が組み合わさって組換えレンチウイルス粒子となり、宿主細胞の膜から出芽します。

放出されたウイルス粒子を含む培地を回収する。

遠心分離して細胞残渣をペレット化し、ウイルス上清をろ過して残留不純物を除去します。

高速遠心分離を行い、完全なウイルス粒子をペレット化します。

上清を捨て、ウイルスペレットを少量の新鮮な培地で再懸濁します。

濃縮した組換えレンチウイルスを低温で保存し、後続のアプリケーションに使用します。

濃縮レンチウイルスの作製を開始するため、1.5 × 10⁶ 個の HEK-293T 細胞を 60 mm ディッシュに播種し、5% CO₂ の加湿インキュベーター内、37 °C で通常培地を用いて培養します。培養 24 時間後、HEK-293T 細胞が 80〜90% のコンフルエンスに達したことを確認し、培地を 3.5 mL の DMEM に交換した後、5% CO₂ の加湿インキュベーター内、37 °C で 2 時間インキュベートします。インキュベーターから細胞を取り出し、培地を 2% FBS 含有 DMEM に交換し、調製したばかりのトランスフェクション複合体混合物を滴下するように細胞に添加します。

液体混合物をゆっくりと混ぜ合わせます。8時間後、細胞培地を3.5 mLの通常培地に交換します。24時間後および48時間後にウイルス上清を回収します。

次に、2つの異なる時点で回収したウイルス上清を混合し、4 °Cで200 × gで5分間遠心分離します。その後、回収した上清を0.45 µmフィルターに通し、ろ液を50 mLの滅菌コニカルチューブに回収します。ろ過したウイルス上清を、4 °Cで一晩（約16時間）6,000 × gで遠心分離して濃縮します。

完了後、コニカルチューブの底にウイルスペレットが見えることを確認します。上清をゆっくりと注ぎ出します。ウイルス上清の1/100の量の通常培地でウイルスペレットを溶解させるために、P1000マイクロピペットを用いて、均一な100倍濃縮ウイルス混合物が得られるまでゆっくりとピペッティングを行います。濃縮ウイルスをマイクロ遠心チューブに分注し、−80 °Cで保存します。