microRNAミミックによるゲノムサイレンシングを通じたウイルス拡散抑制の評価

ヒト上皮様細胞を用いて開始します。

1つ目のウェルには非導入細胞を、2つ目のウェルにはmicroRNA mimicを導入した細胞を含ませます。

トランスフェクションされた細胞内において、microRNA mimicストランドはタンパク質複合体と結合し、RNA誘導サイレンシング複合体を形成します。

培地を除去し、ウイルス懸濁液を添加します。

ウイルスを吸着させるため、インキュベートします。

培地を除去して新しい培地を加え、インキュベートする。

非トランスフェクション細胞において、ウイルスは受容体介在性エンドサイトーシスにより細胞内に進入します。

これによりウイルスゲノムが放出され、それが複製されて多くのウイルス粒子が生成されます。

トランスフェクションされた細胞内では、RNA誘導サイレンシング複合体がウイルスゲノムを認識し、その分解を誘発してウイルス産生を減少させます。

新しいウイルスが放出されます。ウイルスを含む培地を回収します。

遠心分離してデブリを沈殿させ、ウイルスを含む上清を回収します。

上清を非トランスフェクション細胞に添加する。ウイルス感染させるためにインキュベートする。

非トランスフェクション細胞の上清で処理したウェルは、microRNA mimicをトランスフェクションした細胞の上清で処理したウェルと比較して高い細胞死を示しており、microRNAによるウイルス複製抑制が確認された。

このステップでは、トランスフェクション時に細胞密度が80から90%のコンフルエントになるように、許容性細胞を96ウェル組織培養プレートに播種します。次に、トランスフェクション試薬を室温まで温めます。各ウェルに対し、9 µLの無血清培地、200 nMのmicroRNA mimicストック、0.18 µLのブースト試薬、および0.18 µLのトランスフェクション試薬を合わせてマスターミックスを作成し、混合します。

混合物を室温で2〜5分間インキュベートします。その後、ウェルから培地を吸引し、92 µLの新鮮な完全培地を加えます。次に、適切な量のトランスフェクション混合物を細胞に滴下し、37 °Cで6時間インキュベートします。

必要に応じて、トランスフェクション効率を向上させるために、ウイルス感染前にmicroRNA mimicのトランスフェクション後24時間インキュベートすることができます。

次に、ウイルスストックを無血清培地で希釈します。培地を除去し、各ウェルにウイルス希釈液を100 µL加えます。その後、細胞を37 °Cで2時間インキュベートします。2時間後、各ウェルから培地を吸引し、新鮮な完全培地を100 µL加えます。その後、細胞を37 °Cで20〜22時間インキュベートします。

上清液中のウイルス力価を決定するために、各ウェルから上清を回収し、100 µLの新鮮な完全培地と交換します。その後