レポーター含有エボラウイルス転写・複製能を有するウイルス様粒子（trVLPs）の作製

エボラウイルスゲノムを模倣し、ウイルスの構造タンパク質、糖タンパク質、およびルシフェラーゼレポーターをコードするミニゲノムプラスミドから開始します。

T7ポリメラーゼ、ウイルスヌクレオプロテイン、および複製と転写に不可欠なウイルスポリメラーゼ成分をコードするヘルパープラスミドを添加します。

プラスミドに脂質ベースのトランスフェクション試薬を加え、ボルテックスして混合物をインキュベートし、プラスミド-脂質複合体を形成させます。

この混合液をヒト腎細胞に加え、穏やかに混ぜてインキュベートします。

脂質複合体が細胞と融合し、プラスミドが細胞内に導入されます。

ヘルパープラスミドは、それぞれのタンパク質をコードしています。

その後、T7ポリメラーゼがミニゲノムをウイルスゲノムRNAに転写し、それが直ちにヌクレオプロテインで被覆されます。

ウイルスポリメラーゼ複合体がウイルスゲノムRNAに結合し、それをウイルスmRNAへと転写します。これらのmRNAから、ウイルスの構造タンパク質および糖タンパク質が産生されます。

ウイルス蛋白が集合し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含む非病原性の転写・複製能を有するウイルス様粒子（trVLPs）を形成します。

細胞の生存率を維持し、trVLPの産生を促進するため、新鮮な培地で補充してください。

trVLPの作製に必要なプラスミドを細胞にトランスフェクションします。BSC内でフィルターチップを用い、DNAをチューブにピペッティングします。陰性対照として、1つのウェルではウイルスポリメラーゼLをコードするプラスミドを除外し、代わりにGFPをコードするプラスミドをトランスフェクションしてトランスフェクション効率を可視化します。次に、1ウェルあたり100 µLのOptiMEMをDNAに加えます。チューブをボルテックスし、スピンダウンします。

次に、希釈したDNAに7.5 µLのTransit LT1トランスフェクション試薬を加えます。チューブを軽くボルテックスし、室温で15分間インキュベートします。15分後、ピペッティングによってトランスフェクション混合液を穏やかに混合し、6ウェルプレートの各ウェルに100 µLずつ滴下するように加えます。

細胞にトランスフェクション複合物を添加した後、プレートを前後左右に揺らしてください。プレートを回転させるとトランスフェクションが不均一になるため、旋回させないでください。その後、細胞をインキュベーターに戻します。トランスフェクションから24時間後、細胞から上清を除去します。