ヒト胚性腎細胞における抗ウイルス化合物を評価するためのルシフェラーゼベースアッセイ

抗ウイルス活性を評価するため、テスト化合物を連続希釈したマルチウェルプレートを用意して開始します。

ルシフェラーゼ発現組換え麻疹ウイルスを含むヒト胚性腎細胞懸濁液を各ウェルに添加します。

細胞が各ウェルの底面に接着するようにインキュベートします。

試験化合物を含まないコントロールウェルでは、ウイルスが細胞膜と融合し、そのゲノムを細胞質へと放出します。

ウイルスゲノムは、リポータータンパク質であるルシフェラーゼとともに、ウイルスRNAおよびタンパク質の産生を制御します。

試験ウェルにおいて、抗ウイルス化合物がウイルスの複製を抑制し、ルシフェラーゼの産生が減少します。

各ウェルにルシフェラーゼ特異的基質を添加します。この基質がルシフェラーゼと反応し、ルミネッセンスを発します。

プレートリーダーを用いて、各ウェルの発光強度を測定します。

コントロールウェルと比較してテストウェルのルミネッセンスが低いことは、ウイルスの抑制を示しています。

化合物の濃度上昇に伴いルミネッセンスが段階的に減少することは、ウイルス複製が用量依存的に抑制されていることを示しています。

化合物希釈プレートから1 µLを、白いバーコード付き組織培養プレートに加えます。この工程を2回繰り返し、テストプレートを3セット（triplicate）作成します。次に、組織培養プレートに50 µLの培養液を満たします。その後、補充済みDMEMを用いて、6 x 10⁵ cells/mlの濃度でHEK-293T細胞を37.5 ml調製します。

15 mlチューブ2本に、細胞懸濁液をそれぞれ12.5 mlずつ分注します。一方のチューブの細胞に、感染多重度（MOI）0.1でrMV2/lucを感染させます。次に、未感染細胞および感染細胞のセットを、それぞれのHIT化合物プレートに分注します。

1ウェルあたり50 µLの細胞を分注し、プレートを37 °Cで24時間インキュベートします。翌日、rMV2/luc感染細胞の各ウェルに50 µLのホタルルシフェラーゼ基質を添加します。非感染コントロール細胞には、50 µLのルシフェラーゼベースの生存率測定試薬を添加します。