アメーバを用いた混合ウイルス集団からの単一ジャイアントウイルスの分離

コンタミネーションを防止するため、抗菌剤を含む飢餓培地で培養したアメーバから開始します。アメーバは巨大ウイルスの感受性宿主として機能します。

2種類の巨大ウイルスの混合集団を含む希釈ウイルス懸濁液を加えます。

培地の蒸発を防ぐため、培養皿をバッグに入れ、インキュベートします。

ウイルスを希釈することで、個々の細胞が1種類の巨大ウイルスのみに遭遇する確率を高めます。

アメーバがウイルスを取り込み、ウイルスが細胞内で複製されることで、感染細胞は円形化して脱落し、細胞変性効果（CPE）が引き起こされます。

光学顕微鏡下で培養物を観察し、細胞変性効果の徴候を確認します。

次に、ディッシュを倒立顕微鏡のステージ上に移動させます。

倒立顕微鏡下で、マイクロマニピュレーターに取り付けたマイクロキャピラリーを配置します。マイクロキャピラリー内には、細胞吸引を制御するための生体適合性ミネラルオイルが入っています。

マイクロキャピラリーを用いて、感染した単一の円形細胞をそっと吸引し、新鮮なアメーバ培養液中に放出します。その後、インキュベートします。

感染細胞内に蓄積したウイルス子粒子は、エキソサイトーシスによって放出されて隣接する細胞に感染し、単一の巨大ウイルス集団が増殖します。

飢餓培地を用いて、ウイルスサンプルの段階希釈を異なるウェルで実施します。各ペトリ皿に含まれる 1 × 10⁶ 個の Vermamoeba vermaformis 2 mLに、混合接種液 100 mLを接種します。

次に、ペトリ皿を密封可能なプラスチック袋に入れ、30 °Cで保持します。感染から6時間後、倒立光学顕微鏡でペトリ皿を観察し、4〜8時間ごとに細胞形態を確認します。抗菌処理は細胞支持のためです。

ペトリ皿の中から、真菌や細菌による目に見える汚染がなく、ウイルスによるアメーバの細胞病変効果が認められ、かつウイルス粒子の吸引を避けるためにアメーバの事前溶解および円形化段階にあるものを選択します。マイクロマニピュレーター、手動圧力制御装置、倒立顕微鏡、Plug and Play Motor モジュール、カメラ、およびコンピューターモジュールを備えたワークステーションをセットアップします。内部位置の維持と細胞の容易な放出を可能にするため、内径 20 micron のマイクロキャピラリーを選択します。

電動モジュールのグリッピングシステムの動作角度を45度に固定します。まずグリッピングシステムに、次にマイクロキャピラリーに、という順で二段階の設置を行います。細胞にピントを合わせます。

細胞をクローニングするには、2 mLの感染アメーバを含むペトリ皿を顕微鏡下に置きます。まず細胞に焦点を合わせ、次に培養液に浸したマイクロキャピラリーに焦点を合わせます。球状の単一細胞を選択し、マイクロマニピュレーターを用いてマイクロキャピラリーを近づ