免疫刺激タンパク質をコードする組換え麻疹ウイルスの作製

組み換え麻疹ウイルスアンチゲノムプラスミドおよび必須ウイルスタンパク質をコードするヘルパープラスミドを封入したリポソーム懸濁液を用意します。

アンチゲノムプラスミドには、感染細胞において免疫刺激タンパク質および蛍光レポーターを発現するように改変された、麻疹ウイルスのゲノムcDNAが含まれています。

コンタミネーションを防ぐため、抗生物質を含むウイルス産生細胞培養液を用意します。

リポソーム懸濁液を培養液に添加し、インキュベートする。

リポソームが細胞膜と融合し、プラスミドを導入します。

宿主細胞の機構により、アンチゲノムcDNAがRNAに、ヘルパープラスミドがmRNAに転写され、タンパク質発現とウイルス複製複合体の形成が可能になります。この複合体がゲノムRNAを産生し、それによってウイルスタンパク質の発現が可能になります。

ゲノムRNAがウイルスタンパク質とアセンブリし、組換えウイルス粒子を生成します。

感染細胞は、顕微鏡による可視化のための蛍光レポータータンパク質を発現し、ウイルスにコードされた免疫刺激タンパク質を産生します。

感染細胞は多核の合胞体（シンシチウム）を形成し、これは麻疹ウイルスの細胞変性効果の特徴です。

蛍光顕微鏡を用いて大きな蛍光性合胞体を確認し、組換えウイルスの回収が成功したことを確認します。

cDNAから麻疹ウイルスを回収するため、トランスフェクションの24時間前に、麻疹ウイルス産生細胞を6ウェルプレートに均一に播種します。

トランスフェクション時に65～75%のコンフルエンシーになるよう、1ウェルあたり2 mLの10% FBS含有DMEMを用いて200,000個の細胞を播種します。細胞のトランスフェクションに使用する、麻疹ウイルスアンチゲノムをコードするリコンビナントDNA 5 µg、適切なプラスミド、および蛍光リポーターを、合計200 µLのDMEMで混合します。

18.6 µLのリポソーム形質導入試薬を混合液に加え、すぐにチューブを弾いて混ぜ合わせます。この形質導入ミックスを室温で25分間インキュベートします。MV産生細胞に形質導入を行うため、コンフルエンシーが65～75%に達した6ウェルプレートから培地を除去し、1ウェルあたり1.8 mLの2% FBSおよび50 µg/mLカナマイシンを含むDMEMを加えます。

次に、トランスフェクションミックスを各ウェルに滴下し、注意深く旋回させて混ぜます。細胞を37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートします。翌日、培地を2% FBSおよび50 µg/mLカナマイシンを含む新鮮なDMEM 2 mLに交換し、培地が黄色に変化して酸性になった際に同様の交換を繰り返します。

顕微鏡を用いて、レポーター遺伝子の発現とシンシチウム形成を毎日観察します。20個以上の細胞からなる大きなシンシチウムが確認された場合、または細