治療用ウイルス産生上皮細胞の作製および回収

血清含有培地で維持された培養腎上皮細胞を用いて開始します。

この培地を、治療用に免疫調節遺伝子を組み込んだ遺伝子組換えウイルスを含む無血清培地に交換します。

ウイルスを細胞表面の受容体に付着させるため、細胞をインキュベートします。

未吸着のウイルスを含む上清を除去します。

細胞生存のために新鮮な血清含有培地を加え、インキュベートする。

インキュベーション中、ウイルスは受容体介在性エンドサイトーシスによって細胞内に進入してゲノムを放出し、このゲノムがウイルスRNAを産生します。

ウイルスゲノムが複製され、同時にウイルスRNAによって新しいウイルスタンパク質が産生されます。

ウイルス蛋白が新たなウイルス粒子へと組み上がり、周囲の培地中に放出されます。

これらの子ウイルスが隣接する細胞に侵入して感染を引き起こし、感染細胞のクラスターを形成します。

細胞単層をそっと掻き取り、治療用ウイルス子粒子を産生している細胞を回収します。

懸濁液をチューブに回収し、今後の解析のために低温で保存します。

麻疹ウイルスの複製キネティクスを解析するため、感染の1日前に、12ウェルプレートの各ウェルに10% FBSを含むDMEM 1 mLを用いてVero細胞を100,000個播種します。この際、目的とする各タイムポイントにつき少なくとも2ウェルを用意してください。細胞を感染させるため、培地を、所定量のウイルスを含む300 µLの無血清培地に置換します。37 °C、5% CO2条件下で少なくとも2時間インキュベートします。

接種液を除去し、10% FBSを含むDMEMを1 mL添加して、インキュベーションを継続します。感染後の適切なタイムポイントにおいて、細胞を培地中に直接スクレイピングしてウイルス子孫を回収します。各ウェルの内容物を個別のチューブに移します。

液体窒素で急速冷凍し、タイター測定まで-80 °Cで保存した後、原稿に記載されている手順に従って進めます。