ウイルスコード化二特異性T細胞誘導分子の免疫調節活性の評価

標的抗原を発現する遺伝子改変腫瘍細胞を含むテストウェルと、当該抗原を欠損した腫瘍細胞を含むコントロールウェルから開始します。

ウイルス導入遺伝子によってコードされ、標的抗原用とT細胞特異的受容体用の2つの結合部位を持つ二重特異性T細胞誘導因子（BTE）を用います。

BTEおよびT細胞をウェルに添加し、インキュベートする。

テストサンプルにおいて、BTEが腫瘍細胞とT細胞を架橋し、T細胞を活性化させて細胞傷害性顆粒を放出させます。

これにより腫瘍細胞が溶解し、細胞内酵素が放出されます。

コントロールでは、BTEがT細胞にのみ結合するため、腫瘍細胞の溶解は回避されます。

遠心分離し、上清を回収します。

基質を添加し、インキュベートする。

この酵素は、基質を赤色の生成物へと触媒します。

ストップ溶液を加え、色の強度を測定します。

テストサンプルの強度がより高いことは、BTEのターゲット特異的な免疫調節活性を裏付けるものです。

LDH放出によるBTE誘導細胞介在性細胞傷害性の評価を開始するには、まず、原稿に記載されている手順に従い、ウイルス感染標的細胞により発現した分泌型トランスジェーン産物を単離し、免疫エフェクター細胞を単離します。次に、U底96ウェルプレートに標的細胞を播種し、原稿に記載されている各サンプルを準備します。あらかじめ単離した免疫調節剤を目的の濃度で各サンプルに添加します。目的の比率で免疫エフェクター細胞を添加し、培地を加えて1ウェルあたり合計100 µLにします。あらかじめ決定した目的の時間、37 °C、5% CO2条件下でインキュベートします。

細胞を 250 ×g で 4 分間遠心分離します。各ウェルから 50 µL の上清を、細胞が混入しないように注意しながら、平底 96 ウェルプレートのウェルに回収します。

メーカーの指示に従って基質溶液を調製した後、各ウェルに 50 µL ずつ加えます。室温、暗所にて30分間、または Tmax サンプルが濃い赤色になるまでインキュベートします。インキュベーション後、各ウェルに 50 µL の停止液を加えます。

4,000 ×gで1分間遠心分離し、その後、中空針を用いて気泡を除去します。490 nmにおける光学吸光度を測定し、原稿に記載されている通りに算出します。