ゲノム解析に向けた個々のウイルス粒子の蛍光ベースのソーティング

核酸を欠いた欠損ウイルス粒子などの不純物を含む、多様なウイルス混合物の懸濁液を用意します。

これらのウイルスは、ゲノムを持つウイルスを不純物と区別するため、核酸結合性蛍光色素で事前に染色されています。

懸濁液をフローサイトメトリー（FACS）にかけ、個々の粒子の光散乱および蛍光強度を解析します。

光散乱信号は粒子サイズを反映し、蛍光強度は核酸含有量を示します。

蛍光を示さないコンタミネーションおよび、異常に高い蛍光を示す凝集塊を除外してください。

ゲノムを含む単一のウイルス粒子を選択し、固定化のためにアガロースコーティングされたチャンバースライドに直接ソートします。

各ウェルにさらにアガロースを重ねて、ウイルスを封入します。

これで、単一ウイルスゲノムの増幅および解析の準備が整いました。

カスタム前方散乱光光電子増倍管（FSC-PMT）を備えたフローサイトメーターを使用してウイルスをソートします。まず、0.1 μmろ過済みのTris-EDTAでウイルス粒子を希釈します。T4およびlambdaファージ粒子を含む混合集団の場合、信号対雑音比を最大化するために、FSC-PMTを1000、SSCを200に設定します。

コントロールサンプルの測定後、染色したウイルス懸濁液を約100 µL、合計5,000イベントに達するまで流します。次に、SYBR Green IおよびFSC-PMTプロットを用いて、ウイルス粒子の中心にタイトなゲートを設定します。続いて、37 °Cに冷却したTBE緩衝液中の1%低融点アガロースをPTFE顕微鏡スライドの各ウェルに5 µLずつ加え、ソートされたウイルス粒子を捕捉するためにスライドをフローサイトメーターにロードします。

ソーティングを開始し、共焦点レーザー走査顕微鏡によるウイルスの深さの検出を容易にするため、一部のウェルには10個以上のウイルス粒子イベントをキャプチャします。ソーティングが完了したら、フローサイトメーターからスライドを取り出し、37 °Cに冷却した低融点アガロースを各ウェルにさらに5 µL追加し、ウイルス粒子を封入します。