環境水試料からのアメーバを用いた巨大ウイルスの濃縮

飢餓培地で培養されたアメーバを含むマルチウェルプレートを用意します。

飢餓培地には、アメーバを増殖させず、また休止嚢胞を形成させずに生存させたまま、微生物の増殖を抑制する抗生物質および抗真菌剤が含まれています。

環境水サンプルを含むチューブを取り、ボルテックスミキサーで攪拌して、懸濁物質やデブリからウイルスを遊離させます。

ウイルスを含む水試料をアメーバに添加します。

蒸発を防ぐため、濡れたガーゼと共にプレートを袋に入れ、インキュベートする。

インキュベーション中、アメーバは食作用によって巨大ウイルスを取り込みます。

細胞内に取り込まれると、ウイルスはアメーバの細胞質にゲノムを放出します。

細胞質内にウイルス工場が形成され、そこではホストの機構を利用してゲノムを複製し、新たなビリオンへと組み立てられるウイルスタンパク質が産生されます。

これによりアメーバ細胞が丸まって溶解し、新しいビリオンが培地中に放出されるため、後続の検出に向けた巨大ウイルスの濃縮が行われます。

テキストのプロトコルに従って汚水サンプルを採取した後、宿主細胞を調製します。 V. vermiformis アメーバを、30 mlのプロテアーゼ・ペプトン・酵母エキス・グルコース（PYG）培地が入った75 $\text{cm}^2$の細胞培養フラスコに加え、28 °Cで48時間インキュベートする。計数用スライドを用いてアメーバを計数し、濃度が$5 \times 10^5$〜$10^6 \text{ cells/ml}$に達した時点で、$720 \times g$で10分間遠心分離して細胞を回収する。

上清液を吸引し、30 mlの滅菌Page's amoebal saline（PAS）を用いてアメーバペレットを再懸濁します。ペレットを2回目にすすいだ後、抗生物質および抗真菌剤を含む30 mlの飢餓培地を用いて、細胞を約10⁶ amoeba/mlに再懸濁します。飢餓培地は、アメーバが嚢子形成や増殖を行うことなく生存し続けることを可能にします。

次に、96ウェル平底プレートの各ウェルに200 µLのアメーバを播種し、30 °Cで30分間インキュベートします。その後、水サンプルを室温で1分間ボルテックスし、各サンプルの25 µLをアメーバ細胞に接種します。この際、陰性コントロールとしてサンプルを接種しないウェルを2つ設けます。蒸発を防ぐため、プリモカルチャー（初回培養）を含むプレートを濡れた圧縮ガーゼを入れた袋に入れ、その加湿チャンバーごと30 °Cのインキュベーターに入れます。

初回接種の3日後、顕微鏡観察を行うことなく、先ほど示した手順でプリモカルチャープレートを新しいアメーバが入った96ウェルプレートに継代します。30 °Cで3日間インキュベートします。その後、この継代培養物を用いて、前述と同様に3枚目のプレートに接種し、