蛍光顕微鏡を用いた感染性C型肝炎ウイルスの定量

C型肝炎ウイルスを含む哺乳類細胞培養上清を用いて開始します。

ウイルス懸濁液を増殖培地で段階希釈します。

各希釈液を肝癌細胞の単層に接種し、インキュベートする。

ウイルスが細胞内に侵入してゲノムを放出し、非構造性複製タンパク質を含むウイルスタンパク質を発現します。

これにより、出芽して隣接する細胞に感染する新しいウイルス粒子が産生され、感染細胞のフォーカスが形成されます。

インキュベーション後、培地を除去し、固定液を加えます。低温でインキュベートし、細胞の固定と膜の透過処理を行います。

洗浄後、非特異的な抗体結合を防ぐためにブロッキングバッファーを添加します。

非構造複製タンパク質に結合する一次抗体を添加します。

洗浄して、未結合の抗体を除去します。

次に、一次抗体に結合する蛍光標識二次抗体を導入します。

未結合の抗体を除去するために、再度洗浄します。核を染色するためにDNA結合染料を添加します。

蛍光顕微鏡下で観察し、蛍光フォーカスを定量して上清中のウイルス濃度を決定します。

96ウェルプレートを用い、未感染のHuh-7.5.1細胞を1ウェルあたり約3 x 10³個で播種します。翌日、増殖培地を用いて、HCV RNAをトランスフェクションした細胞から回収した細胞不含培養上清の10倍段階希釈を行い、Huh-7.5.1細胞に3連で接種します。感染から72時間後、メタノールを用いて-20 °Cで30分間、細胞を固定します。フリーザーから細胞を取り出した後、前述の条件に従ってHCV NS5Aタンパク質を免疫染色します。蛍光顕微鏡を用いて、ウイルス希釈率が最も高いウェルのNS5A陽性細胞フォーカスをカウントし、1ミリリットルあたりの平均フォーカス形成単位（FFU）数を算出します。