Name: 内因性野生型BRCA1を発現する細胞を用いて相同組換えにBRCA1の変異の影響を識別 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 学ぶBRCA1変異の相同組換え修復への影響を評価するin vitroアッセイ法。RNAiによる内因性BRCA1枯渇と変異体発現プラスミド導入により、フローサイトメトリーでDNA修復効率を定量的に解析する手法です。

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我々はこの仕事のための資金を提供するためのオハイオ州立大学総合がんセンターに感謝しています。

1。統合された組換えの基質を有する細胞株<ol><li> HeLa細胞を安定PDR - GFP（M.ジャシーン、メモリアルスローンケタリング癌センターからプラスミド7贈り物）で形質転換し、形質転換体の選択のためのピューロマイシンで維持した。 </li><li>細胞は、10％ウシ胎児血清、2mMのグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、ペニシリン/ストレプトマイシン（100 U / mL/0.1 mg / mLの）、および1.5 ug / mlとピューロマイシンを含む、DMEM / FBSで継代されています。 </li></ol>プラスミドPDR - GFPの再結合の基質、および安定な形質転換体では、GFPの2つの非アクティブ対立遺伝子（図1）が含まれています。一つの対立遺伝子が原因でI - SCEIは18 bpの制限酵素認識部位のそのコード配列に含めるに不活性である。これらの細胞におけるI - SCEIの発現は、二本鎖DNAの切断（DSB）を作成します。そこにこのDNA上の非アクティブなGFPの第二の対立遺伝子は、ですが、最初の対立遺伝子のI - SCEIのサイトと相関し、その配列の一部は、野生型である。この第二のGFPの対立遺伝子は、DSBの相同組換え修復のためのシーケンスのドナーとして機能することができ、容易にフローサイトメトリーによって検出されるアクティブなGFPの対立遺伝子、になるだろう。また、DSBは、非相同末端結合するI - SCEIの制限部位を破壊するとGFP陰性細胞という結果になる、ことによって修復することができます。セル内の相同組換えのレベルは、GFP陽性細胞の割合を計数することにより決定されます。 この細胞株、pHeLa - DR13 - 9は、ゼロバックグラウンドのGFPの信号とI - SCEI発現プラスミド、pCBASceによるトランスフェクションの際にGFP陽性細胞の比較的高い割合をすべてのクロー​​ンの中から選ばれました。 （pCBASceとそのベクトル制御、pCAGGSは、両方のメモリアルスローンケタリング癌センターのM.ジャシーンによって供給された。） HeLa細胞- DR13 - 9細胞株は、要求に応じて、著者から入手可能です。 2。内因性BRCA1を破壊し、復帰突然変異体BRCA1を追加するためにトランスフェクション。 <ol><li>第一トランスフェクション（通常は火曜日）前日は：HeLa細胞 - DR13 - 9細胞の少なくとも90％コンフルエントの10cmディッシュから始めます。 </li><li> 1 mLのトリプシン処理と9 mLのDMEM / FBSを加えて反応を停止し、ピペッティングによりよく混和する。 </li><li>トリプシン処理細胞の40ウェルあたりのDME / FBSを0.5mL 24ウェルプレートを追加。 </li><li> 1日目のトランスフェクション（水）：はるかに少ないが、最初からやり直す場合細胞は、〜40〜50％コンフルエントにする必要があります。混合によるトランスフェクション：5 pmolのsiRNAは+ 12.5μLのOpti - MEM中でプラスミドDNAを発現さ0.3 UGのBRCA1 -変異体、および12.5μLのOpti - MEMに0.5μLリポフェクタミン2000。リポフェクタミンプロトコル（Invitrogen社）によるとトランスフェクションに進んでください。 </li><li> 4-6時間後にメディアを交換してください。我々はBRCA1を除去するために使用するsiRNAは、80798（アクセッション番号AY273801）にBRCA1 3' - UTR配列の80780を指定してシーケンスのGCUCCUCUCACUCUUCAGUに基づいています。 </li><li> 2日目：6ウェルプレートに24ウェルプレートからトリプシン処理により細胞を転送。 </li><li> 3日目のトランスフェクション：25 pmolのsiRNAを+プラスミドDNAを発現さ0.75 UG BRCA1変異+ 62.5μLのOpti - MEMおよび62.5μLのOpti - MEMに2.5μLリポフェクタミン2000、0.75 UGのpCBASce（またはpCAGGSベクトル制御）。 4-6時間後にメディアを交換してください。 </li></ol> 3。トランスフェクタントの解析。 <ol><li> 6日目に、各ウェルから細胞をトリプシン処理し、1 mLのDMEM / FBSで停止します。 GFPの発現のため細胞を分析する日5または7日に行われますが、我々は最高のその日の6作品を見つけることができます。 </li><li>フローサイトメトリーで1ウェルあたり10,000細胞を分析する。私たちは、オハイオ州立大学総合がんセンター分析サイトメトリーの共有リソースにベクトンディッキンソンFACSキャリバーの楽器を使用してください。シングル、生きている細胞は、前方と側方散乱パラメータを用いてゲートです。 GFP陽性細胞は、GFP蛍光検出器（FL1）を用いて検出され、その結果はヒストグラム（図2、底部）として表示されます。 </li><li>必要に応じて、左上の細胞は蛍光顕微鏡で写真撮影のために色を保ち続けることができます。 </li></ol> 4。代表的な結果： BRCA1は、相同組換え6,11によって二本鎖DNA切断の修復のための経路を調節する。相同組換えによって修復を受けているこれらの細胞は容易に蛍光顕微鏡（図2、上）によって検出されています。検出されたGFP陽性細胞（図2、右）の減少におけるBRCA1の結果の枯渇。 FACSキャリバーからの出力は、X軸とY軸（図2、下）にある細胞の数のセルあたりのGFPの強度ヒストグラムです。単一の実験からの結果の典型的なセットでは、細胞の15.5％がI - SCEIの発現と制御RNAiの枯渇（図3）の後にGFP陽性であった。比較することにより、BRCA1およびベクトルの枯渇は0.7％にGFP -変換を削減再度追加します。追加バック野生型BRCA1のまたはBRCA1（I21V）完全に復元された相同組換えの、として15から16パーセントGFP陽性細胞を取得することによって検出された。追加バックBRCA1（M1の8T）変異体（図3、レーン5）は、ベクトル制御のアドオンバックと同様の効果を持っていた。このバリアントは、内因性のタンパク質9と同様のレベルで発現しているので、我々はこのようにBRCA1（M18T）変異体は相同組換えに非機能的であると解釈。 我々は通常、I - SCEIの発現プラスミドをトランスフェクトした後、GFP陽性に変換細胞の10-20％を持っている。 BRCA1の枯渇は、再現性を約8〜10倍でGFP陽性細胞の転換を減らすことができます。 GFP陽性細胞の実際の割合は、実験内のコントロールの枯渇に対する相対的なBRCA1の枯渇、以下の実験間、GFP陽性細胞の比率に変更される可能性があるところではありますが非常に一貫しています。我々は、100％に制約のない変換速度を設定することで、結果を正規化し、BRCA1の枯渇やパーセンテージなどのアドインが背を向け、結果を表現する。このように、我々は複数の実験を組み合わせることができます、そして実験的な変化は高くありません。 これまでの堅牢な結果が得られているバックBRCA1の変異体の追加：各BRCA1の変異は、完全に相同組換えの活性を回復しているか、効果がなかったしました。これらの結果を得るのに重要な考慮事項は、当社のトランスフェクションの条件は、未処理の細胞の内因性タンパク質の濃度とほぼ等しいBRCA1タンパク質のレベルを生成することである。 BRCA1のであって欠陥のある変異体の過剰発現が高すぎるとは、いくつかの正の相同組換えの活動になることがあります。 我々が克服するために必要な問題は、トランスフェクションの毒性であった。 BRCA1自体の枯渇は細胞の成長を遅らせることができる、と皿上の細胞の数に対して相対的リポフェクタミン- 2000とプラスミドDNAのバランスは、一貫性のあるレベルに維持する必要があります。あまりにも多くのリポフェクタミンまたはプラスミドDNAは、細胞数を減らし、細胞の数は、信頼性の高いフローサイトメトリーの結果を得るには不十分になります。トランスフェクションされた細胞の数に対するプラスミドとリポフェクタミン試薬のバランスが細胞の生存を維持するために非常に重要です。 <img src="/files/ftp_upload/2468/2468fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1組換えの基質。 M.ジャシーン7,12のグループによって開発されていた戦略が描かれている。 PDR - GFPプラスミドI - SCEIの制限エンドヌクレアーゼ部位を含むそのうちの一つGFPの二つの欠陥対立遺伝子が含まれています。 HeLa細胞由来の細胞株は、このDNAのゲノム9つのサイトに統合された基板、およびGFP陽性への一つの対立遺伝子の変換における相同組換えの結果により、I - SCEIのサイトにある二本鎖DNAの休憩のアクティブな修復が含まれています。 <img src="/files/ftp_upload/2468/2468fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。蛍光顕微鏡によるGFP陽性細胞の検出。細胞は、このプロトコルに従って、テスト、および制御枯渇細胞は、GFPの発現（左）と細胞の高い割合で検出される、相同組換えでアクティブであった。 GFP陽性細胞（右）の数の急激な減少のRNAi結果によるBRCA1の枯渇。 <img src="/files/ftp_upload/2468/2468fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。BRCA1のミスセンス変異のアドオンバックの結果。単一の実験からの結果は、このヒストグラムに表示されます。プラスミドを発現しているトランスフェクトI - SCEIの不在（レーン1）で検出さGFP -陽性細胞は存在しない。レーン2-6の結果はすべて発現するプラスミドをI - SCEIは3日目にトランスフェクトされた細胞から採取した。無関係な遺伝子（ルシフェラーゼ）のために枯渇し、ベクトルで、再び追加された細胞で、細胞の15.5％が（レーン2）のGFP陽性であった。 BRCA1およびベクトルアドインバックの枯渇は、相同組換えでBRCA1の損失（レーン3）の効果を明らかにする。 BRCA1の枯渇とアドインバック野生型BRCA1（レーン4）、BRCA1（M18T）（レーン5）、およびBRCA1（I21V）（レーン6）のの効果が示されています。これらの結果は、単一の実験からのもので、特定の変異BRCA1のタンパク質によってサポートされている相同組換えの指標を得るために少なくとも二つ以上の繰り返し実験と組み合わせることになります。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

この方法の利点は、我々は、野生型内因的に発現BRCA1を持つ細胞を用いた相同組換えによるDNA修復を調節する上でBRCA1蛋白質の機能を勉強できるということです。我々は、相同組換えの過程を研究するのとDNA修復の機能のためにBRCA1の変異体をテストするための新規な方法を得るために、RNAiによる枯渇を利用する2つの別々の確立された方法を採用している。この方法の成功の鍵は、我々はGFPの変換の非常に高いレベルを得るようなゲノムの組換えの基質と、そのようなHeLa細胞のような容易にtransfectable細胞株を、確立することだった。我々は、検出可能なバックグラウンドのGFPシグナルを持っていたものを得るために元の変換の複数のクローンをスクリーニングしたが、プラスミドI - SCEIの発現のトランスフェクションによりGFPの変換の非常に高いレベルを持っていた。 この方法では、我々は今相同組換えにおける機能のための他の特定のBRCA1のアミノ酸残基を調査している。この作品からの生物学的洞察と一緒に、これらの結論は、臨床癌の遺伝学に適用することができます。多くの珍しい亜種が存在するので、BRCA1のミスセンス変異の割合が高い未知の臨床的意義を持っており、遺伝的分離分析3,10,13,14によって癌の関連付けを決定するために、これらの多くのための十分な情報があります。この方法を使用して、相同組換えの制御におけるBRCA1の生物学的機能上の特定の変異の影響は、それらのゲノム中にこれらの亜種を運ぶ女性たちに知らせるために使用することができる。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>9871-5200</td><td></td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Invitrogen</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine-2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-GR312</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Invitrogen</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX I</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr></tbody></table>

内因性野生型brca1を発現する細胞を用いて相同組換えにbrca1の変異の影響を識別

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

ミスセンス変異の機能解析は、内因性蛋白質の細胞内の存在によって複雑になることがあります。 BRCA1の構造機能解析は、完全長のBRCA1タンパク質とhypomorphic BRCA1タンパク質1,2,3,4,5を発現する細胞系での作業における固有の困難のための堅牢な分析の欠如によって複雑にされています。我々は、細胞内の内因性のBRCA1タンパク質が急性BRCA1 mRNAの3&#39; - UTRを標的RNAiにより枯渇し、BRCA1の変異型を発現するプラスミドをコトランスフェクトすることにより置き換えられてそれによってシステムを開発した。この手順の利点の一つは、BRCA1と同時交換の急性サイレンシングは、細胞がBRCA1の機能の損失を補償するために、時間の経過とともに発生する可能性のある二次変異または翻案することなく拡張できるようにすることです。この枯渇とアドインバックプロシージャは、容易に相同組換え活性を測定したHeLa細胞由来の細胞株で行われていた。相同組換えアッセイは、組換えの基質がゲノム（図1）6,7,8,9に統合されそれによって以前に発表された方法に基づいています。この組換えの基板は、非アクティブなGFPの対立遺伝子内部に珍しいカットI - SCEIの制限酵素部位を有し、そして下流の第二非アクティブなGFPの対立遺伝子である。相同組換えによって修復されることがあります二本鎖の休憩、のI - SCEI結果を表現し、相同組換えは、ブレークを修復しない場合は、容易にGFPタンパク質の発現のフローサイトメトリーにより採点され、アクティブなGFPの対立遺伝子を作成し、そのプラスミドのトランスフェクション。内因性のBRCA1の枯渇は、相同組換えの活性の8〜10倍減少をもたらし、そして野生型プラスミドを完全に復元された相同組換え機能のバック追加。完全長のBRCA1の特定の点変異体を共トランスフェクトしたプラスミドから発現させた場合、特定のミスセンス変異の効果は、得点することができます。例として、BRCA1（M18T）タンパク質、未知の臨床的意義10の変異体の発現は、これらの細胞で発現され、それはBRCA1依存相同組換えを復元に失敗しました。また意義が不明な別の変異体のそれとは対照的に、表現、、BRCA1（I21Vが）完全に復元されたBRCA1依存相同組換えの機能。 BRCA1のミスセンス変異の機能をテストするのこの戦略は、中心体機能（KAISら、未発表の観察）をアッセイする別の生物学的システムに適用されている。全体的に、このアプローチは、劣性分析する必要があります任意の遺伝子のミスセンス変異体の解析に適しています。

我々は、RNAiを用いて細胞から内因性のBRCA1蛋白質を破壊し、コーディングの変更が含まれているBRCA1点変異体でそれを置き換えることにより、DNA損傷の相同組換え修復のためのアッセイに基づいて組織培養でのBRCA1の変異体をテストするための方法を提供する。

内因性野生型BRCA1を発現する細胞を用いて相同組換えにBRCA1の変異の影響を識別

ミスセンス変異の機能解析は、細胞内に内在性タンパク質が存在することによって困難になる場合があります。...の構造機能解析では...

本実験の全体的な目的は、in vitro 相同組換えアッセイを用いて、BRCA1タンパク質の特定の変異体を検証することです。これは、まずBRCA1に特異的な短干渉RNAと、テスト対象のBRCA1変異体タンパク質を細胞に再発現させるためのプラスミドの両方をトランスフェクションし、内因性の野生型BRCA1タンパク質を変異体に置換することによって達成されます。第二段階として、試験細胞のDNAゲノム上の特定部位にDNA損傷を誘発するI-Sce1タンパク質を発現させるプラスミドに加え、上述の短干渉RNAおよび変異型BRCA1発現プラスミドを導入します。次に、DNA損傷と修復が行われるように細胞を2〜3日間インキュベートします。最終的に、GFP発現細胞のフローサイトメトリー分析に基づき、BRCA1タンパク質の特定のタンパク質変異体が相同組換えによるDNA修復において機能するかどうかを示す結果が得られます。この手法は、相同組換えによるDNA損傷修復における特定のタンパク質変異体を分析するための汎用性の高いシステムを構築するために、2つの確立された手法を組み合わせています。既存の手法に対する本手法の主な利点は、従来の手法がBRCA1を遺伝的にノックアウトした細胞株に依存していた点にあります。本手法では、HELOC細胞由来のより扱いやすい細胞株を使用しており、RNA干渉による内因性タンパク質のBRCA1枯渇と、これらの細胞への試験用タンパク質の再導入を可能にしています。バリアントBRC1タンパク質を発現させた状態で、相同組換えの試験を行います。一般的に、この手法に不慣れな方は、手順中の過剰な細胞死に苦慮することがあります。組換え反応の効果を最大化しつつ、細胞毒性を抑えるために、トランスフェクション条件を慎重に設定することが重要です。本プロトコルの開始に先立ち、HeLa DR 13細胞株をP-D-R-G-F-Pを用いてHeLa細胞を形質導入することで作製しました。安定的に形質導入された細胞を選別するため、10 cmペトリ皿を用い、ピューマイシンを含む培地でこの細胞株を維持しました。P-D-R-G-F-Pプラスミドおよび安定形質転換体内の組換え基質には、2つの不活性なGFPアレルが含まれています。一方のアレルは、I-SceIの18塩基対の制限酵素認識部位が含まれているため不活性となっています。そのコーディング領域において、これらの細胞でISCE1を発現させると、不活性なGFPの第2アレルに二本鎖DNA切断（DSB）が生じます。第1アレルのISCE1サイトに対応する配列部分は野生型です。この第2のGFPアレルは、DSBの相同組換え修復における配列ドナーとして機能し得、その結果、活性型のGFPアレルが生成されます。これは、最初のトランスフェクションの前日にフローサイトメトリーによって容易に検出可能です。コンフルエンシーが90%以上のHeLa DR 13細胞を10 cmディッシュで調製します。1 mLのトリプシンを用いて、2〜3分間細胞を剥離させます。9 mLのDMEM-FBSを加えて反応を停止させ、ピペッティングにより細胞懸濁液を十分に混合します。24ウェルプレートの各ウェルに、0.5 mLのDMEM-FBSで希釈したトリプシン処理済み細胞を40 µLずつ分注します。細胞を37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートします。1日目において、細胞のコンフルエンシーを40〜50%に調整しておきます。内因性b RCA oneを枯渇させるためのirnaと、B RCA one変異体発現プラスミドの両方をoptimum mediaで混合し、トランスフェクションを開始します。次に、これらの核酸をoptimum media中でlipと混合します。メーカーの指示に従ってリポフェクションを行い、トランスフェクションを完了させます。細胞をインキュベーターに戻します。4〜6時間後、抗生物質を含まない培地で培地交換を行います。細胞を戻し、2日目に一晩インキュベートします。各ウェルに0.3 mLのtryple trypsin試薬を加え、37 °Cで短時間インキュベートした後、トリプシン試薬中で細胞をピペッティングして細胞を剥離させます。トリプシン処理が完了したら、トリプシン活性を停止させるため、細胞を24ウェルプレートから2 mLのD-M-E-M-F-B-Sを含む6ウェルプレートに回収します。初回トランスフェクションから2日後、これまでと同じ条件下で6ウェルプレートを一晩インキュベートします。SIR A、BRCA1変異体発現プラスミドDNA、およびISCE1発現プラスミドを62.5 µLのOptumで調製します。この溶液に2.5 µLのLIPECTOMY 2060と2.5 µLのOptumを混合します。4〜6時間のインキュベーション後、細胞にトランスフェクションを行います。培地を抗生物質を含まないD-M-E-M-F-P-Sに交換してください。6日目に細胞をインキュベーターに戻します。各ウェルの細胞に0.5 mLのトリプシン試薬を加えてトリプシン処理します。2 mLのD-M-E-M-F-B-Sを加えて反応を停止させ、室温で1000 RPMで5分間遠心分離して細胞を回収します。回収した細胞を1 mLの新鮮なD-M-E-M-F-B-Sで再懸濁し、1ウェルあたり10,000個の細胞を用いてGFP発現を解析します。フローサイトメトリーにより、前方散乱光と側方散乱光のパラメータを用いて、生存している単一細胞をゲーティングします。GFP陽性細胞はGFP蛍光検出器を用いて選別し、結果をヒストグラムとして提示します。残りの細胞は、蛍光顕微鏡による写真撮影のために再播種することが可能です。目的のBRCA1の顕微鏡観察において、BRCA1は相同組換えによる二本鎖DNA断裂の修復経路を制御します。相同組換えによる修復が行われた細胞は、蛍光顕微鏡によって容易に検出できます。RNAiによるBRCA1の枯渇は、検出されるGFP陽性細胞の急激な減少をもたらします。FCAの結果は、x軸に細胞あたりのGFP強度、y軸に細胞数を示すヒストグラムとして出力されます。形質転換が行われていない、あるいは発現プラスミドを導入していないSCEでは、GFP陽性細胞は検出されません。2列目から6列目の結果はすべて、3日目にISC one発現プラスミドをトランスフェクションした細胞から得られたものです。単一の実験における代表的な結果では、ISC oneの発現および無関係な遺伝子に対するコントロールRNAi枯渇後、15.5%の細胞がGFP陽性となりました。対照的に、BRCA oneの枯渇および空のプラスミドベクターの相補（add back）では、GFP転換率が0.7%まで低下しました。外因性野生型BRCA oneの添加により、15〜16%のGFP陽性細胞が得られ、相同組換え能が完全に回復しました。同様に、別の意義不明の変異体の発現においても、BRCA1 21B変異はBRCA1依存的な相同組換え機能を完全に回復させました。一方、BRCA1 M18T変異体を導入した場合は、ベクターコントロールと同様の結果となりました。このバリアントは内在性タンパク質と同程度のレベルで発現していたため、BRCA one M 18 T バリアントは相同組換えにおいて機能しないことが示唆されます。この手順を行う際は、細胞の増殖を監視することが重要です。細胞の増殖速度は遅く、コンフルエンシーも低いため、使用するトランスフェクション混合液の量を減らす必要があります。また、適切なタイミングでトランスフェクション培地を除去することも重要です。トランスフェクション後の数日間、培地に抗生物質が含まれていると細胞毒性が高くなることがわかりました。そのため、1日目以降のすべての培地からは、調製後に抗生物質を除いています。この手法は、乳がん研究分野の研究者が、がんクリニックにおいて臨床的意義が不明であるBRC 1変異体の遺伝学を探索するための道を切り開きました。本研究で開発した機能的なBRC oneアッセイにより、BRC one変異ががんの素因に及ぼす影響の予測精度が向上することを期待しています。

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