内因性野生型BRCA1を発現する細胞を用いて相同組換えにBRCA1の変異の影響を識別

本実験の全体的な目的は、in vitro 同源組換えアッセイを用いて、BRCA1タンパク質の特定の変異体を検証することです。これは、まずBRCA1特異的な短干渉RNA（siRNA）と、テスト対象のBRCA1変異体タンパク質を再発現させるためのプラスミドを細胞にトランスフェクションすることで、内在性の野生型BRCA1タンパク質を変異体に置換することによって達成されます。第二のステップとして、前述のsiRNAおよび変異型BRCA1発現プラスミドに加えて、テスト細胞のDNAゲノムの特定部位にDNA損傷を誘発するI SCE1タンパク質を発現させるプラスミドを導入します。次に、DNA損傷と修復が行われるよう、細胞を2〜3日間インキュベートします。最終的に、GFP発現細胞のフローサイトメトリー分析に基づき、BRCA1タンパク質の特定の変異体が同源組換えによるDNA修復において機能するかどうかを示す結果が得られます。

本手法は、相同組換えによるDNA損傷修復における特定のタンパク質変異体を解析するための汎用性の高いシステムを構築するため、2つの確立された手法を組み合わせています。既存の手法に対する本手法の主な利点は、従来の手法がBRCA1を遺伝的にノックアウトした細胞株に依存していた点にあります。本研究では、HELOC細胞由来のより扱いやすい細胞株を使用しており、RNA干渉による内在性タンパク質のBRCA1枯渇と、これらの細胞へのテストタンパク質の再導入を可能にしています。

変異型BRC1タンパク質を発現させた状態で、相同組換えの試験を行います。一般的に、この手法に不慣れな方は、手順中の過剰な細胞死により困難に直面することがあります。細胞毒性を抑えつつ組換え反応の効果を最大限に高めるために、トランスフェクション条件を慎重に設定することが重要です。

本プロトコルの開始前に、P-D-R-G-F-Pを用いてHeLa細胞を形質導入し、HeLa DR 13 9細胞株を樹立させました。安定的に形質導入された細胞を選択するため、10 cmペトリ皿を用いてピューロマイシン存在下で細胞株を維持します。P-D-R-G-F-Pプラスミドおよび安定形質転換体における組換え基質には、2つの不活性なGFPアレルが含まれています。一方のアレルは、I-Sce Iの18塩基対の制限酵素認識部位が含まれているため不活性となっています。

これらの細胞において、ISCE oneのコーディング配列が発現すると、不活性なGFPの第2アレルに二本鎖切断（DSB）が生じます。第1アレルのISCE one部位に相関する配列部分は野生型です。この第2のGFPアレルは、DSBの相同組換え修復のための配列ドナーとして機能し、その結果、活性化したGFPアレルが生成されます。これは、最初のトランスフェクションの前日にフローサイトメトリーによって容易に検出されます。

コンフルエンスが90%以上に達したHeLa DR 13細胞の10 cmディッシュを用意し、1 mLのトリプシンで2〜3分間細胞を処理します。9 mLのDMEM-FBSを加えて反応を停止させ、ピペッティングにより細胞懸濁液を十分に混ぜ合わせます。24ウェルプレートの各ウェルに、0.5 mLのDMEM-FBSで希釈したトリプシン処理済み細胞を40 µLずつ分注します。細胞を37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートします。

1日目、細胞のコンフルエンスは40〜50%である必要があります。内因性B RCA 1を枯渇させるためのirnaと、B RCA 1変異体発現プラスミドの両方をOpti-MEM中で混合し、トランスフェクションを開始します。次に、これらの核酸をOpti-MEM中のLipofectamineと混合します。

メーカーの指示に従ってリポフェクションを行い、トランスフェクションを完了させます。細胞をインキュベーターに戻します。4〜6時間後、培地を抗生物質を含まない培地に交換してください。

2日目に細胞を戻し、一晩インキュベートします。各ウェルに0.3 mLのトリプシン試薬を加え、37 °Cで短時間インキュベートした後、トリプシン試薬中で細胞をピペッティングして剥離させます。トリプシン処理後、トリプシン活性を停止させるため、2 mLのDMEM-FBSを含む6ウェルプレートに細胞を24ウェルプレートから移します。

初回トランスフェクションから2日後、6ウェルプレートを以前と同じ条件で一晩インキュベートします。SIR A、BRCA1変異体発現プラスミドDNA、およびISCE1発現プラスミドを62.5 µLのOptumで調製します。この溶液を、2.5 µLのLIPECTOMY 2060および2.5 µLのOptumと混合します。

4〜6時間のインキュベーション後、細胞にトランスフェクションを行います。培地を抗生物質不含のD-M-E-M-F-P-Sに交換します。6日目に細胞をインキュベーターに戻します。

各ウェルに0.5 mLのトリプシン試薬を添加し、細胞をトリプシン処理します。2 mLのD-M-E-M-F-B-Sを添加して反応を停止させ、室温で1000 RPMで5分間遠心分離して細胞を回収します。細胞を1 mLの新鮮なD-M-E-M-F-B-Sで再懸濁し、1ウェルあたり10,000個の細胞を用いてGFP発現を解析します。

フローサイトメトリーにより、前方散乱光および側方散乱光のパラメータを用いて、生存している単一細胞をゲーティングします。GFP陽性細胞はGFP蛍光検出器を用いて分取し、その結果をヒストグラムとして提示します。残りの細胞は、蛍光写真撮影のために再播種することが可能です。

目的のBRCA1の顕微鏡観察により、BRCA1が相同組換えによる二本鎖DNA断裂の修復経路を制御していることが分かります。相同組換えによる修復が行われた細胞は、蛍光顕微鏡で容易に検出可能です。RNAiによるBRCA1の枯渇により、検出されるGFP陽性細胞は急激に減少します。

FCAからの出力は、x軸に細胞あたりのGFP強度、y軸に細胞数を示すヒストグラムです。発現プラスミドを導入していないSCEでは、GFP陽性細胞は検出されません。

2列目から6列目の結果はすべて、3日目にISC one発現プラスミドをトランスフェクトした細胞から得られたものである。単一の実験における代表的な結果では、ISC oneの発現および無関係な遺伝子に対するコントロールRNAi枯渇後、細胞の15.5%がGFP陽性であった。対照的に、BRCA oneの枯渇および空プラスミドベクターの導入により、GFP変換は0.7%に減少した。野生型BRCA oneの外来性導入により、GFP陽性細胞が15〜16%得られ、相同組換えが完全に回復した。

同様に、意義不明の別の変異体の発現について。BRCA1 21B変異は完全に回復しました。BRCA1依存的な相同組み換え機能において、BRCA1 M18T変異体を導入したところ、ベクターコントロールと同様の効果が得られました。

この変異体は内在性タンパク質と同程度のレベルで発現したことから、BRCA one M 18 T変異体は相同組換えにおいて機能しないことが示唆されます。この手順を行う際は、細胞の増殖を監視することが重要です。細胞の増殖速度は遅く、コンフルエンシーも低いため、使用するトランスフェクション混合液の量を減らす必要があります。また、適切なタイミングでトランスフェクション培地を除去することも重要です。

トランスフェクション後の数日間、培地に抗生物質が含まれていると細胞毒性が高く現れることが分かりました。そのため、1日目以降に調製されたすべての培地からは抗生物質を除外しています。この手法は、乳がん研究分野の研究者が、がんクリニックにおいて臨床的意義が不明なBRC1変異体の遺伝学的特性を探索するための道を切り拓きました。

本研究で開発された機能的BRCA1アッセイにより、BRCA1変異によるがんへの罹患しやすさの予測が向上することを期待しています。