ウイルス感染細胞における転写抑制の可視化

ウリジンアナログで前処理した哺乳類細胞が載ったカバーガラスを用意し、一方のグループにウイルスを感染させ、もう一方を非感染の状態にします。

ウイルス感染細胞では、ウイルス蛋白が宿主の転写機構に結合して宿主のRNA産生を抑制しますが、非感染細胞ではRNA合成は妨げられず継続します。

バッファーで洗浄する。パラホルムアルデヒドを加えて細胞を固定し、その後洗浄する。界面活性剤を加えて細胞膜を透過性にし、その後洗浄する。

カバーガラスを加湿チャンバーに移します。

蛍光アジド、触媒、および還元剤を含むクリック染色溶液を加え、暗所でインキュベートします。

還元剤が触媒を活性化し、これにより蛍光アジドがウリジン標識された新生RNAに結合できるようになります。

カバーガラスをバッファーで洗浄し、水に浸した後、余分な水分を取り除きます。

抗退色封入剤を用いて、カバーガラスをスライドガラスに封入し、自然乾燥させます。

倒立蛍光顕微鏡下において、非感染細胞と比較して感染細胞の信号強度が低下していることは、ウイルスによる転写抑制が起こっていることを示しています。

12 mmの円形カバースリップを、12ウェル組織培養プレートの各ウェルに配置します。次に、完全DMEM培地1 mLを用いて293細胞を播種します。細胞を、37 °C、5% 二酸化炭素の加湿インキュベーター内で一晩培養します。実験計画に従い、ウイルスストックを希釈し、1ウェルあたり合計200 µLの液量で、MP-12の感染多重度（MOI）が3となるようにします。1つのウェルを非感染コントロールとして、別のウェルを転写抑制のコントロールとして割り当てます。次に、増殖培地を除去します。ウイルス接種液を加え、加湿インキュベーター内で1時間培養します。接種液を吸引除去します。1ウェルあたり1 mLの新鮮な増殖培地を加え、37 °Cで培養します。感染から15時間後に、増殖培地を1 mMのウリジンアナログである 5-ethynyl-uridine を含む培地に交換します。擬似感染させたウェルの1つに、DNA依存性RNA合成阻害剤である actinomycin-D を 5 µg/mL 加えます。細胞をインキュベーターに戻します。感染から16時間後に培地を除去し、1ウェルあたり1 mLのPBSでカバースリップを1回洗浄します。1ウェルあたり1 mLの 4% パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。1ウェルあたり1 mLのPBSで1回すすぎます。

加湿チャンバーを作成するには、直径10cmの細胞培養皿またはペトリ皿の底にプラスチック製パラフィンフィルムを敷きます。皿の内側の縁に湿らせたペーパータオルを敷き詰めます。次に、細胞を透過処理するために、0.2% Triton X-100含有PBSを1mL加えます。室温で10分間インキュベートします。PBSで3回洗浄した後