フローサイトメトリーを用いたウイルス誘発性ホスト転写抑制の解析

哺乳類細胞の培養液を用意する。テスト用の培養液にはウイルスを感染させ、コントロール用の培養液には感染させない。

ウイルスを吸着させた後、培地を交換します。

ウイルスが細胞内に侵入し、ゲノムを放出します。ウイルスは、宿主の転写因子複合体を不安定化させ、宿主の転写を抑制する病原性タンパク質を発現します。

一方、コントロール細胞は活性化した転写を維持しています。

新生RNAに組み込まれるヌクレオシド類似体を添加します。

洗浄した細胞を回収します。

細胞の構造を維持するために、細胞を固定します。細胞を遠心分離し、バッファーで洗浄します。

界面活性剤を加えて細胞を透過処理し、その後洗浄します。

ヌクレオシド類縁体と反応して新生RNAを標識する化学修飾蛍光色素を添加し、その後、洗浄します。

免疫染色を行い、ウイルス抗原を蛍光標識して感染細胞をマークします。

フローサイトメトリーを用いて、ホストRNAおよびウイルス抗原の蛍光を検出します。

コントロール群とテスト群のRNA蛍光強度を比較します。テスト群において、RNA蛍光の減少を示す下方へのシフトが見られる場合は、ウイルスによる転写抑制が示唆されます。

実験計画に従い、293細胞にMOI 3でMP-12を感染させます。増殖培地を除去し、希釈したウイルスストックを添加して、37 °C、5% CO2の加湿インキュベーター内で1時間インキュベートします。接種液を1ウェルあたり2 mLの新鮮な増殖培地と交換し、ウイルス標識および回収に最適な時間、37 °Cでインキュベートします。その後、模擬感染させたウェルのうちの1つについて、増殖培地を0.5 mM 5-ethynyl-uridineを含む培地と交換します。また、5 µg/mLのactinomycin Dを添加します。細胞をインキュベーターに戻し、1時間インキュベートします。PBSで1回洗浄した後、トリプシン処理により細胞を回収します。回収した細胞を1 mM EDTAを含むPBSで3回洗浄します。細胞を固定するため、ペレットを1 mLの4% PFAに再懸濁し、室温で30分間インキュベートします。1チューブあたり1 mLのPBS-EDTAで1回洗浄します。その後、PBS中の0.2% Triton X-100 0.5 mL中で、室温で10分間細胞を透過処理します。ヌクレアーゼフリーのPBS 1 mLで1回洗浄します。クリック反応のため、蛍光染料を含むクリック染色溶液200 µLに細胞ペレットを再懸濁します。細胞が凝集している場合は、ピペッティングによって再懸濁してください。室温、暗所にて1時間インキュベートします。FACSバッファーで2回洗浄します。