遺伝子導入用レトロウイルス粒子の作製

栄養豊富な培地で培養したヒト腎上皮細胞の培養物から開始します。

血清による干渉を最小限に抑え、トランスフェクション効率を向上させるため、培地を低血清培地へと交換します。

トランスフェクション混合液を細胞に滴下して加えます。

この混合液には、目的遺伝子を組み込んだレトロウイルスDNAコンストラクト、必須ウイルスタンパク質を供給するパッケージングプラスミド、およびプラスミドDNAと複合体を形成してトランスフェクションを促進するポリエチレンイミンが含まれています。

DNA複合体が取り込まれるよう、細胞をインキュベートします。

残存するトランスフェクション試薬を除去するため、培地を交換します。

細胞内でプラスミドDNAが核に移行し、そこでウイルス蛋白および目的遺伝子を運ぶウイルスRNAの産生を誘導します。

これらのコンポーネントがアセンブルされ、組換えレトロウイルス粒子として培地中に出芽します。

ウイルス含有培地を回収し、ウイルスの安定性を維持するために短時間低温で保存します。

遠心分離して細胞残渣をペレット化します。

ウイルス上清を分注し、液体窒素で急速凍結させ、後の遺伝子導入実験のために低温で保存する。

16 cmのペトリ皿に、10%胎児牛血清を添加した18 mLのDMEM培地を用いてBosc23細胞の単一細胞懸濁液を播種します。コンフルエンシーが80%に達するまで、約24時間培養します。次に、MSCVレトロウイルス構築物、pCL-Ecoパッケージングベクター、ポリエチレンイミン、および抗生物質を含まない低血清培地を混合します。この混合液をフローボックス内で室温で20分間インキュベートします。その後、Bosc23細胞の培養液を、37 °Cに予熱し2%胎児牛血清を添加した16 mLのDMEM培地に注意深く置換します。次に、レトロウイルス混合液をBosc23細胞に滴下して加えます。その後、培養物を37 °Cで4時間インキュベートします。

インキュベーション終了後、Bosc23培養液を吸引し、10% fetal bovine serum含有の予熱済みDMEM培地 18 mLを加えます。細胞を37 °Cで48時間インキュベートします。25 mLセロロジカルピペットを使用して、ウイルスを含むBosc23培地を50 mLコニカルチューブに回収します。チューブを4 °Cで保存します。その後、Bosc23細胞に10% fetal bovine serum含有の予熱済みDMEM培地 18 mLを加え、細胞を24時間培養します。

ウイルス上清を 1,500 × g で 10 分間、4 °C で遠心分離します。その後、ウイルスを分注し、液体窒素で急冷して -80 °C で保存します。