T7発現システムを用いたGFPタグ付き組換え呼吸器合胞体ウイルス（RSV）の作製

RSVの複製および転写タンパク質をコードするヘルパープラスミドと、全長でGFPを発現するRSVアンチゲノムcDNAを保持する個別のプラスミドを含むプラスミド混合物を用いて開始します。

各プラスミドはT7プロモーターの制御下に置かれています。

リポソームベースのトランスフェクション試薬を添加し、複合体が形成されるまでインキュベートする。

これらの複合体を、T7 RNAポリメラーゼを発現する遺伝子改変ハムスター腎細胞に導入し、インキュベートする。

プラスミド複合体が細胞内に取り込まれ、そこでT7 RNAポリメラーゼがRSVプラスミドを転写します。

これにより、複製および転写タンパク質をコードするウイルスmRNAが産生され、正鎖のRSVアンチゲノムRNAが生成されます。

宿主の機構を用いて、これらのmRNAは、機能的なRSVポリメラーゼ複合体を形成するウイルス複製および転写タンパク質を産生します。

その後、RSVポリメラーゼ複合体が陽鎖RNAをウイルスゲノムRNAへと変換します。

このゲノムRNAは、構造タンパク質とGFPをコードするウイルスmRNAの合成を誘導します。

蛍光顕微鏡下で緑色蛍光が確認されれば、ウイルス遺伝子が発現し、組換えRSVの産生が開始されたことが証明されます。

トランスフェクションの前日に、BSR-T7/5細胞を完全培地を用いて0.5 million cells/mLの濃度で懸濁します。この細胞懸濁液を、6ウェルプレートの各ウェルに2 mLずつ分注します。プレートを37 °C、5% CO2条件下でインキュベートし、翌日に細胞密度（コンフルエンシー）が80-90%に達するようにします。各ウイルスのレスキューを行うには、まず解凍したリバースジェネティクスベクターをチューブ内で混合し、次いでトランスフェクション試薬メーカーのプロトコルに従ってトランスフェクションを行います。次に、混合したベクターに250 µLの低血清培地を加えます。

別のチューブで、10 µLのトランスフェクション試薬を250 µLの低血清培地で希釈します。両方のチューブを緩やかにボルテックスし、5分間待ちます。両方のチューブの内容物を混合し、室温で20分間置きます。

その間に、BSR-T7/5細胞を1 mLの低血清培地で洗浄し、10%胎児血清を添加した抗生物質不含の最小必須培地（MEM）を1ウェルあたり1.5 mLずつ分注します。必要に応じて、37 °C、5% CO2環境下でインキュベートします。20分間のインキュベーション後、各ウェルにトランスフェクションミックスを500 µL加えます。細胞を37 °C、5% CO2環境下で3日間インキュベートします。レスキュー効率をモニターするため、倒立蛍光顕微鏡を用いて20倍の倍率でGFP蛍光を1日1回観察します。