感染性呼吸器合胞体ウイルス定量のためのプラーク滴定法

呼吸器合胞体ウイルス（RSV）懸濁液の段階希釈液を用意します。

RSV感受性哺乳類細胞を播種したマルチウェルプレートの各ウェルに、それぞれの希釈液を接種します。

ウイルスが細胞表面の受容体に結合し、膜融合を媒介してゲノムを細胞質へ放出させるため、インキュベートします。

次に、ウイルスの拡散を制限するために半固形オーバーレイ培地を加え、インキュベートします。

感染細胞は、細胞間融合を媒介するウイルス融合タンパク質を発現し、シンシチウム（合胞体）と呼ばれる多核構造を形成します。

ウイルスの複製が進むにつれて、これらのシンシチウムは退化し、プラークとして知られる透明な領域を形成します。

プレートを軽く揺らしてオーバーレイを除去し、細胞を洗浄してデブリを取り除きます。

生存細胞を染色し、プラークを未染色のままにするための染料を適用します。

染料を除去し、プレートを漂白剤で除染した後、水で洗浄します。

プレートを風乾させる。

明確なプラークが形成されているウェルを選択し、それらをカウントしてウイルス力価を決定します。

プラーク力価測定を行うには、まず市販の10X MEMを滅菌水で希釈し、L-グルタミン、1,000 units/mLのペニシリン、および1 mg/mLのストレプトマイシンを加えて2X 最小必須培地（MEM）を調製します。希釈液を激しく振盪し、4 °Cで保存した後、FCS不含MEMを900 µLずつ6本のチューブに分注します。ウイルス分注液を融解し、5秒間激しくボルテックスします。

段階希釈を行うには、まず最初のチューブにある 900 microliters の培地に 100 microliters のウイルスを加えます。チューブにキャップをし、数秒間ボルテックスして内容物を混合します。次に、最初の希釈液 100 microliters を2番目のチューブにある 900 microliters の培地に加えます。チューブにキャップをし、ボルテックスします。この手順を6番目のチューブまで繰り返します。HEp-2 12-well プレートにウイルスの名称と完全な希釈倍率を記入します。染色中にプレートとカバーが離れる可能性があるため、それらが一致するように印を付けてください。

プレートから培地を除去し、1つの希釈液を1ウェルあたり400 µLずつ分注します。ウイルス吸着のため、プレートを37 °Cで2時間インキュベートします。ウイルスの吸着が行われている間に、まず指示薬の色を確認しながら、7.5%の滅菌重曹水を用いて2X MEMのpHを約7.2に調整し、微結晶セルロースオーバーレイを調製します。

100 mLのオーバーレイを作成するには、10 mLの2X MEM、10 mLの2.4%単結晶セルロース懸濁液、および80 mLの2% FCS添加MEMを加え、激しく混合します。2時間のインキュベー