放射標識逆転写酵素アッセイによるウイルス複製能力の評価

試験用のHIV-1変異株または野生型コントロールのいずれかで感染させた宿主細胞から放出された子ウイルス粒子を含む培養上清を採取します。

試験ウイルスは、複製効率を変化させ、子ウイルスの産生に影響を及ぼす遺伝子変異を保持している。

放射標識ヌクレオチド、非標識ヌクレオチド、RNAテンプレート、プライマー、共因子、界面活性剤、および安定剤を含む逆転写混合液に、上清を添加する。

界面活性剤がビリオンを溶解して逆転写酵素（RT）を遊離させている間に、インキュベートしてテンプレート–プライマー複合体の形成を促します。

RTはテンプレート–プライマー複合体からDNAを合成し、放射標識ヌクレオチドを取り込みます。

サンプルを核酸結合膜に移し、風乾させて放射標識DNAを固定します。

攪拌しながらバッファーとエタノールで繰り返し洗浄し、未結合成分を除去します。

メンブレンを風乾させ、ラップで包む。放射線感受性スクリーンに感光させ、フォスホリメイジャーを用いてシグナルを検出する。

テストにおけるシグナルの減少はRTレベルの低下を示しており、対照と比較してビリオン産生が減少していることを反映しています。

この手順では、1 mlずつに分注したRTマスターミックスに、10 mCi/mlのdTTPを1～2 µl、1 Mのジチオスレイトールを4 µl加えます。1,000 µlピペットを用いて、RTマスターミックス、DTT、およびdTTPが入った各1.5 mlマイクロ遠心チューブを注意深く混合し、滅菌済みのトラフに移します。

次に、ラベル化されたRTミックスを25 µLずつ、96ウェル薄壁PCRプレートの各ウェルに分注します。RTマスターミックスを含むPCRプレートに、各上清を5 µlずつ加えます。その後、PCRプレートを粘着剤付きフォイルカバーで密封し、サーモサイクラーを用いて37 °Cで2時間インキュベートします。インキュベート後、200 µlマルチチャンネルピペットを使用して、フォイルカバーに小さな穴を開けます。サンプルを5回混合します。各サンプルを5 µlずつDE-81紙に転送し、すべてのサンプルを10分間風乾させます。ブロットを個別の洗浄容器に入れます。続いて、ブロットを1x SSCで5回洗浄します。その後、90%エタノールで1回5分間、2回洗浄し、風乾させます。乾燥後、ブロットをサランラップで丁寧に包み、密閉カセットに入れて、室温で一晩フォスフォスクリーンに露光させます。

準備が整ったら、フォスホリイマジナーでフォスフォスクリーンを解析し、放射性転写物を定量します。