ルシフェラーゼを用いたウイルス定量のためのサンプル調製

遺伝子改変ウイルスに感染させた上皮細胞を含むマルチウェルプレートを用意して開始します。

このウイルスは、ルシフェラーゼ酵素をコードする外来遺伝子を保持しています。

白壁マルチウェルプレートに、上皮細胞の新鮮な培養物を準備します。

ウイルス濃度が未知の上清を、白壁のウェルに転移します。

同時に、標準試料として既知濃度のウイルスを添加します。

プレートを遠心分離して、ウイルス粒子と宿主細胞表面受容体の密接な接触を促進し、その後インキュベートする。

ウイルスは宿主細胞に侵入し、マイナス鎖RNAゲノムを放出します。

その後、ウイルスのRNAポリメラーゼがゲノムをmRNAに転写します。

宿主の細胞機構を用いて、mRNAがルシフェラーゼを含むウイルスタンパク質へと翻訳されます。

宿主細胞内に蓄積されるルシフェラーゼの量は、ウイルス濃度の増加に伴って増加します。

これで、ルシフェラーゼアッセイを用いてウイルス濃度をさらに推定するためのサンプル準備が完了しました。

無血清DMEMを用いてVSV-Delta-51の標準曲線を作成し、Vero細胞に転移させた後の最終的な1mlあたりのプラーク形成単位（pfu）濃度が以下のようになるようにします。Vero細胞1プレートにつき、各濃度の溶液を50 μl（さらに10%の余剰分を含む）準備します。標準曲線は96深孔プレートに分注して転移させることができます。次に、透明底96ウェルプレートに播種したVero細胞を光学顕微鏡で観察し、単層が少なくとも95%コンフルエントであることを確認します。12チャンネルマルチチャンネルピペットを用いて、サンプルの上清25 μlを白壁プレートに播種したVero細胞に転移させ、同時に、指定された2列のVero細胞に標準曲線の各希釈液を25 μlずつ加えます。プレートを室温で430 ×gにて5分間遠心分離します。その後、加湿5% CO2インキュベーターにて37 °Cで5時間インキュベートします。