レンチウイルス感染マウス胚性幹細胞の作製

抗生物質耐性遺伝子を組み込んだレンチウイルスを用いて開始する。

遠心分離してデブリを分離する。ウイルスを含む上清を回収し、界面活性剤フリーのメンブレンに通す。

これにより、不純物を除去しつつ、レンチウイルスのみを通過させることができます。

超遠心分離機を用いてウイルスを濃縮する。上清を除去し、バッファーを加えてウイルスを再懸濁させる。

その後、懸濁液をマイクロ遠心チューブに移し、ボルテックスで攪拌します。

遠心分離して気泡を除去します。次に、マウス胚性幹細胞を含む感染培地にウイルスを添加し、混合します。

ウイルスと細胞の接触を促進するために遠心分離し、その後インキュベートする。

ウイルスが細胞内にゲノムを導入します。

培地を除去し、新鮮な培地を加えてインキュベートする。

ウイルスゲノムはDNAに変換されて宿主ゲノムに組み込まれ、抗生物質耐性タンパク質の合成を指示するmRNAの産生が可能になります。

培地を選択抗剤を添加した新鮮な培地で交換し、インキュベートする。

抗生物質耐性タンパク質を発現している細胞のみが生存し、これにより安定したウイルス感染細胞が得られる。

ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測する。

感染の1日前に、あらかじめ調製したmESCを12ウェルプレートに播種し、1ウェルあたり100,000個の細胞にします。10 cmディッシュで培養している細胞の場合、古い培地を吸引して除去し、5 mLの1X PBSを加えて洗浄後、PBSを吸引し、1 mLの0.25%トリプシンを加えます。37 °Cで8分間トリプシン処理を行い、処理時間の途中でプレートを揺すったり叩いたりします。

培地交換の48時間後、293T-HEK細胞の上清を除去し、50 mLコニカルチューブに移します。上清を300 ×gで5分間遠心分離し、細胞残渣をペレット化します。次に、上清を0.45 µmメンブレンでろ過します。SW32ローターを備えた超遠心機を用いてウイルスを濃縮し、4 °Cで72,000 ×gにて2.5時間回転させます。超遠心によるウイルス濃縮の間、12ウェルプレート内のCiA mESCに、5 µg/mLのポリブレンを含む新鮮な胚性幹細胞（ES）培地を添加します。ウイルスの濃縮が完了したら、上清を慎重に吸引し、気泡が入らないよう注意しながら、ウイルスペレットを100 µLの1X PBSに慎重に懸濁させます。

ウイルスと1X PBSを1.5 mLマイクロフュージチューブに加えます。チューブを最低設定でボルテックスし、ウイルスを完全に懸濁させます。ミニ卓上遠心機でチューブを5〜10秒間スピンダウンし、気泡を除去します。

12ウェルプレートの各ウェルにウイルスを30 µLずつ加える。プレートを回転させて混ぜた後、サンプルを1,000 ×gで20分間遠心分離する。12ウェルプレートを37 °Cのインキュベーターに戻し