代謝および蛍光選択を用いた組換えワクシニアウイルス感染細胞の同定

ワクシニアウイルスを感染させ、組換えプラスミドベクターをトランスフェクションした上皮細胞から開始します。

このベクターは、ウイルスプロモーターの下流に、緑色蛍光タグ付きの標的遺伝子および赤色蛍光タグ付きの代謝選択遺伝子を保持しています。

ウイルスDNAの複製過程において、プラスミドカセットがウイルスゲノムに挿入されます。

無血清培地で細胞を回収する。

凍結融解サイクルを用いて細胞を溶解し、ウイルスを放出させます。

ライセートの段階希釈液を調製します。

希釈したライゼートを用いて新鮮な上皮細胞を感染させ、個々のプラークを分離させます。

細胞生存のための血清含有培地と代謝選択試薬を加え、インキュベートする。

選択試薬は、ヌクレオチド合成に関与する酵素を阻害します。代謝選択遺伝子を保持している感染細胞のみが代替酵素を発現してヌクレオチド合成を可能にし、生存することができます。

培地を除去し、蛍光顕微鏡下で観察する。

プラークに赤色と緑色の両方の蛍光が認められることは、カセットの組み込みと標的遺伝子の発現が成功していることを示しています。

無血清培地中で、BS-C-1細胞の単層にワクシニアウイルスを感染させます。

感染1時間後、Dulbecco's modified eagle mediumで細胞をレスキューします。血清不含培地中で、組換えベクタープラスミドとトランスフェクション試薬を3:1の比率で混合してトランスフェクションを行います。24時間後、胎児ウシ血清を含まないDMEM中で細胞をスクレイピングして回収します。細胞を3回の凍結融解サイクルに供し、細胞を破砕してウイルス粒子を放出させます。次に、個々のプラークを十分に分離させるため、BS-C-1細胞の100%コンフルエントな細胞単層に、ウイルス粒子調製液の段階希釈液を感染させます。10% FBSおよびDMEMにGPT選択試薬を加えた液でオーバーレイし、24時間インキュベートします。

液体オーバーレイを吸引し、蛍光顕微鏡を用いて、TDSベクター由来のmCherryがウイルスに組み込まれたことに対応する、拡散した赤色蛍光を示すプラークを確認します。標的遺伝子および選択した蛍光タグによっては、同一の赤色プラーク内でタグ遺伝子の局在化した蛍光が観察される場合もあります。