がん細胞におけるアデノウイルス導入とsiRNAによるノックダウンの併用

内因性標的タンパク質を発現しているヒト癌細胞の培養液を用意し、培地を除去します。

フルオロフォア標識標的タンパク質をコードする遺伝子を搭載した組換えアデノウイルスの懸濁液を用意します。

ウイルスと細胞表面が十分に接触するように、少量のウイルス懸濁液を細胞に添加します。

ウイルスの吸着を促進するため、時々揺らしながらインキュベートします。

培養液を追加してください。

次に、内因性標的タンパク質のmRNAを標的とするsiRNA-リン酸カルシウム複合体を導入し、インキュベートします。

リン酸カルシウムがsiRNAの取り込みを促進し、siRNAがRISCにロードされます。

その後、siRNA–RISC複合体が標的mRNAに結合して切断し、タンパク質の発現を抑制します。

同時に、アデノウイルスが細胞内に進入してDNAを放出し、これにより蛍光標識された標的タンパク質の発現が誘導されます。

これにより、内因性の標的タンパク質の枯渇と、蛍光標識タンパク質による同時置換が可能になります。

細胞を緩衝液で洗浄し、蛍光イメージングを行って標的タンパク質を解析します。

各条件につき1.5 mLマイクロ遠心チューブにラベルを貼り、温めたalpha MEM minusを400 µL加えます。氷上でウイルスの分注液をゆっくりと融解させた後、各ウイルスの必要量をチューブに加え、ピペッティングで穏やかに混合します。次に、細胞から培地を吸引し、ウイルス混合液をゆっくりと滴下して加えます。細胞を37 °C、5% CO2条件下でインキュベートします。1時間の間、15分ごとに滅菌フード内でプレートを慎重に揺らし、ウイルスが細胞全体に行き渡るようにします。少量の培地を使用することで、ウイルスと細胞の接触が促進されます。

インキュベーション後、各プレートにalpha MEM minusを1.6 millilitersずつ緩やかに分注し、全量を2 millilitersにします。その間に、マイクロチューブに滅菌水139 microliters、1 molar 塩化カルシウム50 microliters、および20 micromolar siRNAを11 microliters加え、siRNAトランスフェクションミックスを調製します。siRNAが不要な場合は、siRNAの量を滅菌水に置き換えて空のトランスフェクションを行います。塩化カルシウムsiRNA混合液にHBSS-2X溶液をゆっくりと一滴ずつ加えます。沈殿が小さいほどトランスフェクション効率が向上するため、200 microliterピペットを用いてエアインジェクションで2回緩やかに混合します。その後、混合液を室温で30分間インキュベートします。インキュベーション後、各プレートに200 microlitersをゆっくりと一滴ずつ加え、撹拌して混ぜ合わせます。プレートを37 d