設計されたウイルス様粒子の表面露出システイン残基の標識

感染したタバコ葉から精製した変異ウイルス様粒子（VLP）の懸濁液を用いて開始します。

変異型VLPは、ウイルスのコートタンパク質の特定の位置に遺伝的に導入されたシステイン残基を含んでいます。

マレイミド修飾された蛍光色素を加え、混合物を暗所でインキュベートします。

マレイミドはVLP表面に露出したシステイン残基にのみ結合し、タンパク質構造の内部に埋もれたシステインはアクセス不能なままとなり、ラベル化されません。

還元剤を添加し、未反応の色素をブロックして非特異的な標識を防ぎます。

多孔性樹脂を充填した脱塩カラムにサンプルをロードし、遠心分離して標識したVLPを精製します。

未反応の染料および還元剤は多孔性樹脂ビーズに拡散して保持される一方、よりサイズの大きいVLPは孔から排除され、先に溶出します。

蛍光標識したVLPは、ゲル電気泳動を用いて解析することが可能です。

ゲル上の蛍光バンドは、システイン残基が表面に露出した標識変異体を示しています。

MRFV野生型およびシステイン変異コートタンパク質遺伝子を搭載したPotato virus Xベースのベクタープラスミドからキャップ付きT7-RNA転写物を調製した後、10 µLずつの2分注を用いてN. benthamianaの葉2枚に接種します。植物を温室内で、湿度60％、25 °Cで16時間の明期および20 °Cで8時間の暗期として10日間培養します。培養終了後、ウイルス感染葉を採取し、植物組織を計量して氷上に置きます。テキストのプロトコルに従ってウイルス様粒子（VLP）を精製した後、50 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.0、1 mM EDTA）を用いて1 mM Fluorescein-5-maleimide溶液を調製します。ボルテックスで完全に溶解させ、アルミホイルを使用して溶液を遮光します。1 µg/µLのVLP約30 µLとFluorescein-5-maleimide 60 µLを混合し、室温で2時間、または4 °Cで一晩インキュベートします。最終濃度が50 mMとなるようにDTTを添加して反応を停止させます。脱塩スピンカラムを用いて、未反応のフルオレセインを除去します。架橋可能なシステイン残基を有するVLPを可視化するため、各反応液10 µLに2xサンプルバッファー10 µLを添加し、SDS-PAGE分析を行います。ラベル化されたタンパク質は、遮光して4 °Cで最大1ヶ月間、または使い切り分に分注して-20 °Cで最大3ヶ月間保存してください。