宿主免疫応答を評価するためのマウスへのマウスヘルペスウイルス経鼻感染法

呼吸器への投与に適した位置に固定し、麻酔をかけた健康なマウスを用いて開始します。

感染を誘導するために、マウスヘルペスウイルスを経鼻投与します。

ウイルスは気道を通り、肺に到達します。

肺の内部で、ウイルスは肺上皮細胞に感染し、ヌクレオカプシドを放出します。

ウイルスゲノムが核内に進入し、ウイルスRNAへと転写されます。

宿主の細胞質センサーがウイルスRNAを認識し、特定の転写因子を活性化するシグナル伝達経路を開始します。その後、これらの因子がサイトカイン遺伝子の発現を促進し、抗ウイルスサイトカインの産生に至ります。

感染後、安楽死させたマウスを解剖し、肺組織を採取します。

肺葉1つをシリカビーズを含むチューブに入れ、冷やした培地を加えます。

組織をホモジナイズして細胞を破砕し、抗ウイルスサイトカインを含む細胞内成分を放出させます。

ホモジネートを氷上で冷却し、組織が完全に破砕されるよう、再度ホモジナイズを行います。

遠心分離して細胞残渣をペレット化します。

ヘルペスウイルス感染に対する宿主免疫応答を評価するため、抗ウイルスサイトカインを含む上清を回収します。

麻酔をかけたC57-black-sixマウスに、天然のマウス病原体であるgamma herpes virus 68を40 PFU含む40 µlの液を経鼻的に接種します。感染後の実験的なタイムポイントでマウスを犠牲にした後、胸骨に沿って左側方から切開し、鋭い鋏で肋骨を切断して肺組織を回収します。

左葉を、500 µlの1.0 mm Zirconia/Silicaビーズを含む滅菌済みの1.5 mlねじ蓋付きチューブに入れます。1 mlの冷えた無血清DMEMを加え、ビーズビーティングにより肺組織を30秒間ホモジナイズします。

チューブを氷上で2分間冷却し、ビーズビーティング工程をもう一度繰り返します。次に、チューブを4 °Cで遠心分離し、上清を回収します。その後、市販のサイトカインELISAキットを用い、製造元の手順に従って目的のサイトカインを測定します。