遺伝子組換えE. coliにおけるウイルス様粒子の作製

lacオペレーターによって制御されたT7ポリメラーゼ遺伝子および発現プラスミドを保持する、遺伝子組換えE. coli細胞のスターター培養液が入ったチューブを用意します。

このプラスミドは、バクテリオファージQβ由来のコートタンパク質をコードする遺伝子を保持しています。

この遺伝子はT7プロモーターおよびlacオペレーターによって制御されています。

培養物を培地を含むフラスコに移します。

細菌の増殖を促進するため、振盪培養を行います。

lacリプレッサーを不活性化するアロラクトースの合成アナログを添加し、T7ポリメラーゼの発現を誘導します。

その後、T7ポリメラーゼがプラスミド上のT7プロモーターに結合してコートタンパク質遺伝子を転写し、それが翻訳されてコートタンパク質が生成されます。

これらのコートタンパク質は自己集積して、非感染性のスキャフォールドを形成するウイルス様粒子（VLP）となります。

培養液を遠心管に移します。

遠心分離を行い、細胞をペレット化します。

上清を捨て、ペレットをチューブに移します。

細胞内VLPを含む細胞ペレットが、精製の準備完了となりました。

Q-Betaバクテリオファージの発現手順を開始する前に、ベンチエリアを1:1の漂白剤：エタノール溶液で拭き上げます。無菌環境下で、E.coli BL21のシングルコロニーをSOB培地に加え、3 mLのスターター培養液を2本作成します。これらの培養液を、温度37 °C、相対湿度0%の室内で、250 rpmで振盪しながら一晩培養します。翌日、2本の3 mLスターター培養液を振盪機から取り出し、無菌環境下で、それぞれ1 Lの新鮮なSOB培地が入った2 Lのバッフル付き三角フラスコに注ぎます。接種した培地が入った2本のフラスコを、温度37 °C、相対湿度0%の室内の振盪機（250 rpm）に設置します。600 nmにおける吸光度（OD 600）が0.9〜1.0に達するまで細菌を培養します。これには通常、約5時間かかります。培養液が目的のOD 600に達したら、P1000ピペットを用いて、各フラスコに1 M IPTGを1 mL添加し、タンパク質の発現を誘導します。フラスコを温室内の振盪機にセットしたまま、一晩放置します。

翌朝、シェーカーからフラスコを取り出し、各フラスコの内容物を1 Lボトルに移し、4 °Cで20,621 × gにて1時間遠心分離して細胞を回収します。遠心分離が完了したら、細菌を死滅させるために約5 mLの漂白剤を入れたフラスコに上清を注ぎ、廃棄します。

細胞ペレットを回収するために、スパチュラを使用して遠心分離ボトルの底から細胞ペレットを掻き取り、そのペレットを50 mL遠心チューブに移します。