ジスルフィド再架橋によるウイルス様粒子の蛍光機能化

カプシド表面にジスルフィド結合が露出したウイルス様粒子（VLP）を用いて開始します。

還元剤を添加してジスルフィド結合を切断し、カプシド構造を維持したまま遊離チオール基を生成させます。

チオール基の再酸化を防ぐため、還元したVLPをチオール反応性ポリエチレングリコール（PEGリンカー）と結合させます。

PEGリンカーが2つの共有結合を形成することにより、各チオールペアを再架橋します。

この共有結合による接合により、UV照射下で明るい黄色に発光する蛍光構造も形成されます。

完全に結合させるため、混合液を長時間回転させます。

遠心ろ過を用いて、未反応の低分子を除去し、完全な結合体を保持させることで、PEG化VLPを精製します。

非還元SDS-PAGEを行い、蛍光を発するコートタンパク質のバンドによって、PEGの結合を確認します。

ネイティブアガロースゲル電気泳動を用いて構造的完全性を評価し、PEG化および非PEG化VLPで同様のバンドが確認されれば、完全なVLPが存在することが確認されます。

このプロトコルにより、イメージングや標的配送アプリケーションに適した、蛍光性を有しPEGで機能化されたVLPが得られます。

この概略図は、これから実演する接合を示しています。Q-Beta 1 mgあたりのジスルフィドに対する10当量のTris(2-carboxyethyl)phosphine（TCEP）を用い、室温で1時間かけてすべてのジスルフィドを還元し、還元型Q-Betaカプシドを生成させます。Q-Betaのジスルフィドを還元する直前に、新鮮なTCEP溶液を調製してください。

0.002 gのTCEPを1 mLの超純水に溶解し、100Xストック溶液を作成します。5 mg/mLのQβ 200 µLをマイクロ遠心チューブに加えます。次に、100X TCEPストック溶液 20 µLを同チューブに加えます。室温で1時間インキュベートします。

その間に、還元されたジスルフィドの再架橋反応に使用するジブロモマレイミド・ポリエチレングリコール（DB-PEG）溶液を調製します。0.0017 gのDB-PEGを100 µLのジメチルホルムアミドに溶解させます。ここに10 mMのリン酸ナトリウム溶液（pH 5）を680 µL加えます。次に、還元したQβをDB-PEG溶液に加え、ハンドヘルドの365 nm UVランプの下で混合過程を観察します。混合すると、直ちに明るい黄色の蛍光が視認できるはずです。この反応液をロティセリーにかけ、室温で一晩反応させます。

翌朝、1X PBSを用い、4 °C、3,283 x gで20分間、遠心フィルターで反応混合物を精製します。最後に、非還元SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動およびネイティブアガロースゲル電気泳動により、コンジュゲーションを確認します。