細菌人工染色体由来合成RNAをトランスフェクションした細胞からの感染性ビリオンのレスキュー

ウイルス感受性のある接着性細胞の単層から開始します。

細胞を洗浄し、解離剤を加えて細胞を剥離させます。

遠心分離し、上清を捨てる。細胞を洗浄して残留培地を除去する。

細胞を緩衝生理食塩水で再懸濁し、キュベットに移します。

バクテリア人工染色体に組み込まれた全長日本脳炎ウイルス（JEV）cDNAクローンから転写されたRNAを導入します。

電気パルスを印加して細胞膜を一時的に透過させ、RNAを導入させます。

細胞を回復させた後、培地に移します。

導入されたRNAは天然のウイルスRNAを模倣し、新しいビリオンを産生します。

細胞を段階希釈し、新鮮な細胞単層の上に播種します。

ビリオンが隣接する細胞に感染するようにインキュベートします。

アガロース培地をオーバーレイし、インキュベートします。培地が半固形層を形成し、ウイルスの近接細胞への拡散が抑制されます。

感染細胞は溶解して個別のプラークを形成し、これにより感染性JEVのレスキューが成功したことが確認されます。

150 mmディッシュに3 × 10⁶ cells/dishの密度で播種し、24時間培養したBHK-21細胞を使用します。細胞単層を冷たいSolution Aで洗浄し、トリプシン処理により細胞を剥離させます。270 × gで2分間遠心分離して細胞を回収します。

次に、細胞を50 mlの冷 Solution Aで再懸濁し、再度遠心分離します。この洗浄工程を3回繰り返します。最後の洗浄後、細胞をSolution A中で2 × 10⁷ cells/mlの密度で再懸濁します。その後、細胞懸濁液の400 µl分注量を、2 mmキュベット内で2 µgの合成RNAと混合します。

最適な条件下で混合物を速やかにエレクトロポレーションし、細胞を10分間静置させます。その後、細胞を600 µLの完全培地を含むマイクロ遠心チューブに移します。次に、エレクトロポレーション後の細胞を1 mLずつの量で10倍段階希釈します。各希釈液の100 µL分注量を、通常のBHK-21細胞の単層の上に播種します。4〜6時間インキュベートした後、FBS添加MEM中の0.5%アガロースを細胞の上に重層し、さらに4日間培養します。