透過電子顕微鏡観察のための安全なウイルス検体調製法

バイオコンテインメントキャビネット内で、TEMグリッドが入ったカプセルに強伝染性のウイルス懸濁液を吸引します。

ウイルスがグリッド全体に均一に付着するように、水平にインキュベートします。

遊離ウイルスを含む懸濁液を除去し、次にタンパク質を架橋するための固定液を加えて、ウイルスの構造を保持させるとともに感染性を低下させます。

インキュベーション後、洗浄して残留した固定液を除去します。

電子密度の高い陰性染色剤を添加します。これにより、ウイルスの周囲のグリッドが染色され、観察時のコントラストが向上します。

ピペットを取り外し、グリッドをブロットして過剰な染色剤を除去します。

カプセルを、四酸化オスミウムを浸したフィルターペーパーが入った遠心チューブに入れ、チューブを密封して蒸気固定のためにインキュベートします。

四酸化オスミウムは脂質膜構造を安定化させ、イメージングのコントラストを向上させるとともに、ウイルスを完全に不活化させるため、バイオコンテインメント外への安全な搬出が可能になります。

TEM施設内でグリッドを洗浄し、風乾させた後、イメージングのために保存します。

この手法により、ウイルス試料のより安全な取り扱いが可能となり、試料調製が簡便になります。

まず、カプセルをピペットに取り付けます。ウイルス懸濁液 40 µLをカプセル内に吸引します。グリッドを水平にした状態で、ピペットを横にして10分間放置します。次に、ピペットを持ち上げ、ウイルス溶液を廃棄容器に分注します。2%グルタルアルデヒド固定液 40 µLをカプセル内に吸引します。ピペットを横にして20分間放置します。その後、固定液を排出し、脱イオン水 40 µLをカプセル内に吸引して、固定液を洗い流します。この洗浄工程を3回繰り返します。

次に、1%酢酸ウラニルまたは1%リンタングステン酸カリウムを40 µL、カプセル内に吸引します。そのまま30秒間静置します。その後、ピペットからカプセルを取り外します。

フィルターペーパーをグリッドの端に触れさせ、水分を吸い取ります。フィルターペーパーを15 milliliters遠心チューブに移します。次に、フィルターペーパーを1%四酸化オスミウム溶液に浸します。

蓋を開けた状態でカプセルをチューブに入れます。四酸化オスミウム蒸気が完全に浸透するように、チューブを1時間密閉します。その後、チューブを除染し、バイオコンテインメント外のBSL-2 EM施設へ搬送します。

遠心チューブからカプセルを取り出し、ピペットに取り付けます。40 µLの脱イオン水をカプセル内に吸引し、その後、廃棄容器に排出します。この水洗工程を3回繰り返します。

次に、ピペットからカプセルを取り出します。フィルターペーパーを用いて、グリッドをブロットして乾燥させます。グリッドを風乾させ、TEMイメージングを行うまでグリッドボッ