ウイルス様ヌクレオカプシド粒子のin vitro再構成および精製

ウイルス特異的な、リコンビナント発現させたRNAフリーのヌクレオカプシドタンパク質–リンタンパク質複合体を用いて開始します。

複合体をウイルス特異的RNAオリゴヌクレオチドとともにインキュベートし、ヌクレオカプシド様粒子の構築を開始させます。

アセンブリの間、ウイルスRNAがホスホプロテイン断片を置換し、それによりヌクレオプロテインがRNAを包み込み、ヌクレオカプシド様粒子が形成されます。

サンプルを遠心分離し、沈殿物を除去します。

あらかじめ平衡化した多孔性樹脂充填のサイズ排除クロマトグラフィーカラムを用意し、そこに上清をロードする。

サンプルがカラム内を流れる際、大きなヌクレオカプシド複合体はポアから排除され、最初に溶出します。

中サイズのタンパク質複合体および小さなRNA分子はポアに進入し、後に溶出します。

溶出液の吸光度をモニタリングし、明確なピークを持つ溶出プロファイルを生成します。

最初のピークは構築されたヌクレオカプシドを示し、それに続いてより小さいタンパク質複合体および遊離RNAが現れます。

検証およびさらなる解析のため、ヌクレオキャプシドのピークに相当する画分を回収します。

ウイルス特異的なヌクレオカプシドをアセンブリさせるには、精製したN0P複合体とRNAオリゴを1:1.5のモル比で混合し、室温で1時間インキュベートします。小スケールの精製用ゲルろ過カラムをバッファーEで事前平衡化し、遠心分離によって沈殿物を除去します。

上清をサイズ排除クロマトグラフィーカラムにロードします。タンパク質とRNAのアセンブリサンプルと、タンパク質のみのコントロールサンプルのサイズ排除クロマトグラフィーの画像を比較し、核酸純度比と合わせて、どのピークがアセンブリされたN-RNA、N0P、および遊離RNAであるかを特定します。N-RNA複合体を回収するには、N-RNAピークのすべての分画を回収し、RNA抽出を行い、尿素-PAGEゲル電気泳動を実施して、特定のRNAの長さを再確認します。