透過電子顕微鏡によるE型肝炎ウイルスナノ粒子の可視化

ガラススライド上に配置したカーボンコート透過電子顕微鏡（TEM）用グリッドを用意して開始します。

スライドをチャンバー内に配置し、グロー放電を適用してカーボン表面を親水化し、サンプルを均一に広がるようにします。

スライドを取り出し、ピンセットでグリッドを保持して、E型肝炎ウイルス（HEV）ナノ粒子の懸濁液を滴下します。

これらのナノ粒子は、組換えHEVカプシドタンパク質で構成されており、核酸および副次的なウイルスタンパク質を含んでいません。

ナノ粒子がグリッド表面に吸着するようにインキュベートします。その後、フィルターペーパーでブロッティングし、余分な懸濁液を吸収させます。

脱イオン水でグリッドを洗浄して吸着していないナノ粒子を取り除き、再度ブロットします。

酢酸ウラニル染色液を加え、短時間インキュベートする。

酢酸ウラニルはナノ粒子の周囲に電子密度の高い背景を形成し、これによりTEMイメージング時のコントラストが向上します。

余分な染色剤を吸い取り、グリッドを除湿室に入れて乾燥させます。

TEM下では、HEVナノ粒子は、ウイルス核酸を欠いた均一で中空の正二十面体構造として観察されます。

TEMイメージングのために、HEVナノ粒子サンプルを10 mM MES (pH 6.2)を用いて0.5～2 mg/mLに希釈します。親水性のカーボン表面を作成するため、カーボンコートグリッドを40 mAのグロー放電で30秒間イオン化します。グリッドの親水性カーボン表面は、グロー放電処理後30分間しか持続しません。イオン化後、ピンセットでグリッドを保持し、HEVナノ粒子サンプル2 µLをグリッドに添加します。

15～30秒後、フィルターペーパーでグリッドをブロットします。次に、直ちに二回蒸留水でグリッドを洗浄し、再度フィルターペーパーでブロットします。直ちに2%ウラニル酢酸を2 µL、グリッドに加えます。15秒後、フィルターペーパーでグリッドをブロットします。サンプルグリッドを電子除湿ドライキャビネットに入れ、一晩乾燥させます。

サンプルによっては、構造の可視化および特性評価にクライオ電子顕微鏡（cryo-EM）が必要な場合があります。グリッドをTEMに導入し、10〜80kの倍率で撮影します。HEVナノ粒子は、ウイルスRNAが存在しないため、TEMでは直径約27 nmの空の正二十面体タンパク質として観察されます。